微滴式數(shù)字PCR定量檢測禽腦脊髓炎病毒方法的建立

謝志勤,謝芝勛,張艷芳,范 晴,謝麗基,萬麗軍,羅思思,李 孟,張民秀,曾婷婷,黃嬌玲,王 盛,李 丹,韋 悠,李小鳳,任紅玉,阮志華

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國-東盟(廣西)跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西 南寧 530001)

禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV) 是引起雞發(fā)生急性、高度接觸性傳染病的一種常見病原之一,該病毒除感染雞外,還會引起雉雞、鵪鶉和火雞等禽類致病[1]。AEV對雞危害嚴重,尤其是雛雞,1～7日齡的雛雞感染后,病毒主要侵害雛雞的中樞神經(jīng)系統(tǒng),初期引起雛雞出現(xiàn)震顫、運動失調(diào)等癥狀,故又被稱為流行性震顫。隨著病情加重,雛雞開始行走不便,食欲減退,最后因衰竭而死亡,死亡率高達25%。AEV感染產(chǎn)蛋雞及種雞,雖沒有表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)和運動失調(diào)等癥狀,引起的死亡率也低,但對產(chǎn)蛋雞及種雞的產(chǎn)蛋量產(chǎn)生嚴重影響,使產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量突然下降5%～10%[2-3]。更為嚴重的是產(chǎn)蛋雞或種雞感染AEV后可以成為隱性帶毒者,對雞造成持續(xù)感染或潛伏危害,病毒不但可以經(jīng)種蛋垂直傳播,導致雞胚孵化率、出殼率下降[4],還造成防控困難。有效防控AEV的關(guān)鍵是早診斷及早預防,實驗室方法如病毒分離鑒定[5]、PCR[6]、熒光PCR[7-9]、LAMP[10]等是診斷AEV的最準確方法,但這些方法或多或少都存在一些不足或檢測局限,尤其是對隱性帶毒及感染早期的雞中AEV載量低時的檢測,尚沒有很好的方法。

近年來,隨著微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,使得該技術(shù)在很多領(lǐng)域迅速得到應用[11-13]。其技術(shù)方法是將反應液通過油包水方式分為獨立的數(shù)萬個納米反應微滴,根據(jù)每個反應微滴信號逐個統(tǒng)計帶熒光(陽性)與未帶熒光(陰性)微滴個數(shù)與比例,并自動計算出核酸(陽性模板)的微滴數(shù)(拷貝數(shù))來實現(xiàn)對核酸的絕對定量,結(jié)果更為直觀準確。由于ddPCR具有特異、敏感和準確定量的特點,對AEV隱性感染及感染早期的準確檢測成為可能。

本研究采用AEV VP1基因為靶基因,通過在靶基因保守序列中設計引物和探針,并應用合成的引物和探針研究建立ddPCR檢測AEV的方法,旨在為檢測診斷AEV提供更加準確的技術(shù),為有效防控AEV提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株AEV Van株和AEV 19株、禽偏肺病毒(acian metapneumovirus,aMPV)MN-10株由美國康涅狄格州大學MAZHAR I.KHAN教授惠贈;雞傳染性喉氣管炎病毒(avian infectious laryngotracheitis virus,ILTV)BJ株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)Mass 41株、禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV) S1133株、雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus,H9N2 AIV)066C株均由本實驗室保存;65份病雞腦樣品分別于2020年1-12月從廣西5個雞場中采集,保存于-70℃。

1.2 主要試劑Supermix for Probe ddPCR(No dUTP,Lot:1863024)、Droplet Generation Oil for Probes ddPCR(Lot:1863005)、Droplet Reader Oil(Lot:1863004)、DG8 Cartridges(Lot:1863008)、DG8 gaskets(Lot:1863009)、Pierceable Foil Heat Seal(Lot:1814040)購自美國Bio-rad公司;EasyPure Virual DNA/RNA Kit(Lot:N20527)、Gel Extration Kit(Lot:L41118)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RT-PCR(PCR)擴增試劑盒、100bp DNA Ladder、pMD18-T、大腸桿菌DH5α、T4連接試劑盒、凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器微滴生成儀(QX200 Droplet Generator)、熱封儀(PX1)、微滴數(shù)字讀取儀(QX200 Droplet Reader)、梯度PCR擴增儀(T-100)購自美國Bio-rad公司;熒光 PCR 儀(quantStudio 5)、分光光度計(Nanodrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 引物設計與合成根據(jù)GenBank中已發(fā)表的AEV VP1 基因序列(No.JQ894852.1),利用在線(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)軟件設計ddPCR特異性引物和探針,并在線對設計的引物和探針序列進行BLAST分析。在探針序列的5′端添加FAM熒光基團,3′端添加BHQ1淬滅基團。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并進行HPLC純化,引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針寡核苷酸序列

1.5 重組質(zhì)粒標準模板的構(gòu)建與鑒定將提取的AEV Van株RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板,然后用設計的引物APV-F/APV-R進行擴增后,將大小約160 bp條帶的電泳凝膠切下并回收純化,與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-AEV。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定,序列正確的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA用分光光度儀測定D260 nm/D280 nm的值,并按公式計算拷貝數(shù)?？截悢?shù)=(濃度×阿伏加德羅常數(shù))/(1個堿基對的平均分子質(zhì)量×總長度)。

1.6 ddPCR反應的建立及條件優(yōu)化20 μL反應體系:2×Supermix 10 μL,5.0～40.0 μmol/L的AEV-F/AEV-R引物各1 μL,2.5～40.0 μmol/L的AEV-Pro 1 μL,重組質(zhì)粒經(jīng)DNA 1 μL,加滅菌ddH2O補足至20 μL。微滴生成:在DG8 Cartridges的第2排孔分別加入上述反應液20 μL,第3排孔每孔加入Droplet Generation Oil 70 μL,蓋上DG8 gasket,置微滴生成儀上自動生成微滴于第1排孔。封膜:吸取生成的微滴至96孔板內(nèi),加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal置PX1熱封儀上,程序設置為180℃ 10 s進行封膜。PCR擴增:封膜的96孔板放入PCR擴增儀上進行擴增,設計反應程序:95℃ 10 min;94℃ 30 s,退火溫度設置54～61℃ 1 min(2℃/s),共進行40個循環(huán);98℃ 10 min,4℃結(jié)束。數(shù)據(jù)讀取及分析:反應結(jié)束后將96孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號并進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 ddPCR特異性測定按EasyPure Virual DNA/RNA試劑盒說明書方法,提取AEV Van、AEV19以及H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV的RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。提取ILTV的DNA,然后分別加入已優(yōu)化好的ddPCR反應體系中進行特異性檢測。

1.8 ddPCR靈敏性及重復性測定測定重組質(zhì)粒DNA的濃度并作10倍遞減稀釋,取10-4～10-11共8個連續(xù)稀釋的重組質(zhì)粒DNA作為模板加入到已優(yōu)化的ddPCR反應中,以驗證ddPCR反應的靈敏性。用同樣的引物和探針對相同重組質(zhì)粒DNA的濃度進行熒光定量PCR平行檢測,比較2種方法的反應靈敏性。取10-5～10-8共4個連續(xù)稀釋的重組質(zhì)粒DNA進行4次平行試驗,分析ddPCR檢測的線性區(qū)間。取10-5～10-7共3個連續(xù)稀釋的重組質(zhì)粒DNA進行3次重復試驗,以檢測ddPCR的重復性,分析檢測結(jié)果的變異情況。

1.9 臨床樣品檢測取約5 g腦樣品按1∶8加入無血清的MDEM培養(yǎng)基進行研磨,-70℃反復凍融3次,4 000 r/min離心5 min,取上清200 μL,按EasyPure Virual DNA/RNA Kit說明提取樣品的核酸,用建立的ddPCR方法進行檢測;同時引用文獻[9]中熒光定量PCR方法進行檢測,比較2種檢測方法的檢測效果和符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標準模板的鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒pMD18-AEV經(jīng)PCR擴增鑒定,結(jié)果擴增出大小約160 bp的明亮條帶。重組質(zhì)粒pMD18-AEV送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定,測定的序列用MegAlign軟件與AEV VP1基因(No.JQ894852.1)序列進行Clustal W Method分析,分析結(jié)果為測定的序列與AEV VP1基因100%同源,證明插入片段序列正確。用分光光度儀測定重組質(zhì)粒pMD18-AEV的D260 nm/D280 nm值為1.95,經(jīng)計算質(zhì)粒質(zhì)量濃度為0.107 g/L,按公式計算拷貝數(shù)為6.1×108拷貝/μL。

2.2 ddPCR 反應退火溫度的優(yōu)化ddPCR反應中,采用20 μmol/L的AEV-F/AEV-R引物濃度和10 μmol/L的AEV Pro濃度各1 μL(終濃度分別為1.0,0.5 μmol/L),加入模板濃度約為610拷貝/μL時,退火溫度設置為54,55,56,57,58,59,60,61℃共8個不同梯度進行ddPCR反應擴增,結(jié)果退火溫度為58℃時,陽性微滴信號(顯示為藍色)和陰性微滴信號(顯示為黑色)之間的熒光信號區(qū)分明顯,擴增獲得的陽性微滴數(shù)最高,為605拷貝/μL,綜合這些因素,確定最佳擴增的退火溫度為58℃。

2.3 ddPCR 反應引物及探針濃度的優(yōu)化ddPCR反應中對不同的引物濃度和探針濃度進行優(yōu)化,結(jié)果當引物AEV-F/AEV-R的終濃度分別為1.0 μmol/L,探針AEV-Pro的終濃度為0.5 μmol/L時,檢測到的陽性微滴信號最高,且陽性微滴與陰性微滴之間的熒光信號區(qū)分明顯。此時的引物和探針終濃度被確定為最佳的引物和探針濃度。

2.4 ddPCR 反應的建立及反應程序根據(jù)優(yōu)化結(jié)果,ddPCR反應體系為20 μL,包含:2×Supermix10 μL,20 μmol/L AEV-F/AEV-R引物各1 μL(終濃度為1 μmol/L),10 μmol/L AEV-Pro 1 μL(終濃度為0.5 μmol/L),模板DNA/RNA 1 μL,用ddH2O補足至20 μL。反應程序:95℃ 10 min;94℃ 30 s,設置退火溫度58℃ 1 min(2℃/s),40個循環(huán);98℃ 10 min,4℃結(jié)束。

2.5 ddPCR反應特異性測試結(jié)果提取AEV Van、19以及H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV的RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,提取ILTV的DNA,然后分別加入已優(yōu)化好的ddPCR反應體系中進行特異性檢測,結(jié)果各孔擴增生成的總微滴數(shù)(包括陽性和陰性微滴)均達10 000以上,且較均衡,微滴擴增條件成立,出現(xiàn)陽性微滴的樣品只有AEV Van和AEV19,對照的H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV、ILTV沒有出現(xiàn)陽性微滴,且與AEV也沒有出現(xiàn)交叉反應,結(jié)果表明特異性強(圖1)。

1.AEV Van;2.AEV19;3.H9N2 AIV;4.IBV;5.ARV;6.NDV;7.APV;8.ILTV

2.6 ddPCR靈敏性測定結(jié)果取10-4～10-11共8個連續(xù)稀釋的pMD18-AEV重組質(zhì)粒DNA各1 μL作為模板,分別按照優(yōu)化的ddPCR和熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示,ddPCR對重組質(zhì)粒DNA的最低檢測限為5.9拷貝/μL(10-8稀釋),而熒光定量PCR只檢測出10-7稀釋的質(zhì)粒標準品(61.4拷貝/μL),結(jié)果見圖2,3。結(jié)果表明,本方法建立的ddPCR檢測敏感性比熒光定量PCR高10倍,敏感性較高。用10-5～10-8共4個連續(xù)稀釋的pMD18-AEV重組質(zhì)粒DNA進行ddPCR檢測,檢測結(jié)果的拷貝數(shù)在5.9～6 150.0拷貝/μL之間,用檢測結(jié)果的陽性拷貝數(shù)對數(shù)值與對應稀釋的拷貝數(shù)的對數(shù)值繪制的絕對定量曲線,線性方程為y=-0.97x+8.68,結(jié)果為線性。由圖4可知,R2值為0.999 4,斜率為-0.97x,表明檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

1～8.10-4～10-11 pMD18-AEV DNA

1～8.10-4～10-11 pMD18-AEV DNA

2.7 臨床樣品的檢測結(jié)果對65份雞腦病料樣品的檢測,ddPCR檢測結(jié)果有3份樣品為AEV陽性,檢測拷貝數(shù)為120,135,246拷貝/μL,62份樣品為AEV陰性,陽性檢出率為4.62%(3/65),與qPCR檢測的結(jié)果一致。部分樣品檢測結(jié)果見圖5,表2。

圖4 AEV ddPCR標準曲線

1.pMD18-AEV重組質(zhì)粒(陽性對照);2.SPF雞腦樣品(陰性對照);3.腦樣品3(+);4.腦樣品5(-);5.腦樣品16(+);6.腦樣品18(-); 7.腦樣品31(+);8.腦樣品35(-);9.腦樣品38(-);10.腦樣品40(-);11.腦樣品42(-);12.腦樣品45(-);13.腦樣品48(-);14.腦樣品50(-);15.腦樣品55(-);16.腦樣品65(-)

3 討論

AEV感染可引起包括雞、雉雞、鵪鶉和火雞等家禽致病,特別是對1周齡以內(nèi)的雛雞危害特別嚴重,除了引發(fā)雛雞出現(xiàn)震顫、運動失調(diào)等癥狀外,嚴重時還會導致雛雞大批死亡。AEV感染產(chǎn)蛋雞和種雞時雖不會引起大批死亡,但也會導致產(chǎn)蛋量下降,種胚孵化率降低。及時準確診斷是防控AEV的關(guān)鍵手段之一,常規(guī)的實驗室診斷方法如原分離鑒定診斷周期長、技術(shù)要求高而達不到快速診斷的目的。普通PCR方法較分離鑒定具有較好的特異性和敏感性,但也不夠敏感,存在漏檢現(xiàn)象。熒光定量PCR方法比普通PCR方法敏感性高,但對一些病毒載量較低如感染早期或隱性感染時期的樣品,也存在檢測的局限性而檢測不到病原,且不能進行絕對定量。在這種情況下,需要找到一種更敏感的檢測方法才能滿足臨床樣品檢測的要求。本研究建立的ddPCR檢測AEV方法,是在AEV VP1基因序列上設計引物和探針,通過對引物探針濃度及反應條件等進行優(yōu)化后而建立的一種方法,經(jīng)特異性檢測驗證,本方法只檢出AEV,沒有檢出常見的多種禽病病原,且與禽病病原無交叉反應,特異性好。靈敏性檢測表明最低檢測限為5.9拷貝/μL,ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏性高10倍,與劉洋等[14]報道的ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏10倍的結(jié)果一致,敏感性好。因此,本方法的建立及應用,對AEV的及早診斷,及早做好相應預防,降低由AEV感染引起的發(fā)病率和死亡率均有重要意義。

表2 65份臨床樣品檢測結(jié)果

本研究中引物和探針濃度是直接影響敏感性檢測的關(guān)鍵因素,為了獲得更好和更敏感的擴增效果,需要對引物和探針濃度進行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)引物終濃度為1.0 μmol/L,探針終濃度為0.5 μmol/L的情況下,即引物與探針濃度比為2∶1時,ddPCR擴增反應獲得的AEV陽性微滴信號(藍色)最高,且陽性微滴與陰性微滴之間區(qū)分明顯,反應具有最低的負熒光幅度,敏感性也高。同時,該方法通過對4個連續(xù)稀釋的pMD18-AEV重組質(zhì)粒DNA進行檢測,用檢測結(jié)果的陽性拷貝數(shù)對數(shù)值與對應稀釋的拷貝數(shù)的對數(shù)值繪制的絕對定量曲線,結(jié)果為線性。進一步說明本研究建立的方法穩(wěn)定好,結(jié)果可靠,為ddPCR方法的臨床應用提供可靠技術(shù)。

ddPCR方法從出現(xiàn)至今,由于其具有較高的靈敏性和絕對定量,使得該技術(shù)在各領(lǐng)域得到廣泛應用與發(fā)展,在動物疫病檢測方面已發(fā)揮了重要作用[15-17]。目前制約該技術(shù)應用發(fā)展的主要問題是儀器設備及試劑昂貴,隨著技術(shù)的進步以及ddPCR儀器、試劑國產(chǎn)化的普及,相信在不久的將來,檢測成本有望大幅度降低,操作也會進一步簡單化。

綜上所述,本方法具有特異性好、靈敏性高和絕對定量的特點,能滿足臨床對病毒載量較低的樣品的檢測,為及時準確絕對定量檢測AEV提供技術(shù)支撐,對有效防控AEV感染有重要現(xiàn)實意義。