豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

閆曉光,丁慶文,任豪杰,張宇航,李澤輝,胡 慧,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

在引起豬腸道腹瀉的主要病毒中,豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus,PSV)在豬場(chǎng)中的感染率居高不下,這4種病毒均可引起豬不同程度腹瀉。PDCoV、PEDV、TGEV屬于冠狀病毒,其中PEDV屬于α屬冠狀病毒,常引起仔豬急性腹瀉、脫水和嘔吐等消化道癥狀,死亡率高,自20世紀(jì)70年代在歐洲發(fā)現(xiàn)后[1],迅速在世界各地?cái)U(kuò)散開(kāi)來(lái)。本病在國(guó)內(nèi)最初報(bào)道于上世紀(jì)70年代后期,在2010年底,中國(guó)大部分省份暴發(fā)與PEDV相似癥狀的急性腹瀉,經(jīng)證實(shí)屬于PEDV強(qiáng)毒株G2型[2]。2013年,美國(guó)暴發(fā)的PEDV疫情,導(dǎo)致生豬產(chǎn)量下降10%[3]。TGEV屬于α屬冠狀病毒,可感染不同年齡段的豬群,以2周齡以下的仔豬為主,常表現(xiàn)為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉等消化道癥狀,死亡率高達(dá)100%[4]。PDCoV屬于δ屬冠狀病毒,可引起腹瀉、嘔吐等消化道癥狀,死亡率在30%～40%之間,在我國(guó)香港于2012年首次發(fā)現(xiàn)[5]。本病于2014年在美國(guó)暴發(fā)了大范圍的流行,隨后在世界其他國(guó)家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[6-9]。PSV是小RNA病毒科、薩佩羅病毒屬中無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒,呈球形,PSV基因組全長(zhǎng)7.5～8.3 kb,是最小的RNA病毒[10]。PSV自1960年在英國(guó)首次報(bào)道后,世界各地都有發(fā)現(xiàn)PSV引起的感染流行。該病毒最初是從呈現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀的豬腸道組織中分離得到,命名為豬腸道病毒8型(PEV-8),后經(jīng)序列分析將其歸類為薩佩羅病毒屬[11]。PSV可感染不同階段的豬,導(dǎo)致腹瀉、肺炎、繁殖障礙等癥狀, 2周齡以下的哺乳仔豬感染后死亡率為100%,5周齡以上的豬死亡率極低[12]。

丁慶文等[13]對(duì)臨床上采集的92份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PEDV、PDCoV和PSV的三者混合感染率為3.26%,PEDV分別與PSV和PDCoV的感染率均在22.00%以上。韋學(xué)雷等[14]對(duì)采集的176份豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PEDV、PDCoV和TGEV三者混合感染率為1.13%。針對(duì)這4種病毒之間混合感染的現(xiàn)象,通過(guò)臨床診斷和病理變化不易區(qū)分,需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行鑒別診斷。

目前臨床上常用的診斷方法包括RT-PCR、熒光定量PCR、ELISA等,但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)針對(duì)這4種豬主要腹瀉病毒建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法。本試驗(yàn)針對(duì)PSV、TGEV、PDCoV和PEDV 4種病毒的保守基因片段設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化,建立了豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法。并對(duì)該方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性進(jìn)行試驗(yàn)。利用建立的檢測(cè)方法對(duì)臨床上收集的48份病料進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性。試驗(yàn)旨在為PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的流行病學(xué)調(diào)查和疾病防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒及病料樣品來(lái)源PDCoV、PEDV、TGEV、PSV和豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)毒株以及豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)的陽(yáng)性病料均是由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存;豬瘟病毒(swine fever virus,CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)公司。病料樣品來(lái)自2018—2021年河南、山西和湖南養(yǎng)殖場(chǎng)豬的腸道組織和糞便共48份。

1.2 主要試劑TransZol試劑購(gòu)自全氏金生物公司;PCR相關(guān)試劑、pMD18-T載體、DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;質(zhì)粒抽提純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)公司;DMEM液體培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、組織基因組 DNA提取試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司等。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成從GenBank中下載PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的基因序列,通過(guò)MEGA軟件進(jìn)行基因序列比對(duì),針對(duì)PSV VP1基因、TGEV M基因、PDCoV N基因和PEDV N基因的保守片段分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1),引物由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒核酸的提取以及反轉(zhuǎn)錄利用TransZol試劑提取PSV、TGEV、PDCoV、PEDV 4種病毒液和CSFV、PRRSV 2種疫苗中的RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;將PRV、PCV-2的陽(yáng)性樣品研磨后,在4℃離心機(jī)中離心(5 000 r/min,10 min),吸取上清提取DNA,PPV的病毒液可直接用于DNA的提取。

1.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備分別以PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的cDNA為模板,用相應(yīng)的引物經(jīng)過(guò)PCR變溫?cái)U(kuò)增,得到4種病毒的目的片段。反應(yīng)體系:酶13.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,水9.0 μL,模板2.0 μL,共25.0 μL體系。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳,將膠回收后的產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接,再轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并經(jīng)菌液PCR鑒定,經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒送往河南尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。

用紫外分光光度計(jì)測(cè)出4種病毒的質(zhì)粒濃度,根據(jù)公式:拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質(zhì)粒總長(zhǎng)度),計(jì)算出拷貝數(shù)。

1.6 豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.6.1單一PCR擴(kuò)增 分別以4種病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,參考1.5的PCR反應(yīng)條件和程序進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后,于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.6.2多重RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 以混合的4種陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,參考1.5的PCR反應(yīng)條件和程序,進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化(50,52,54,56,58,60℃),對(duì)4種病毒引物不同終濃度之間的組合(0.25,0.50,0.75 μmol/L)進(jìn)行篩選,確定優(yōu)化后的多重RT-PCR反應(yīng)體系和條件。

1.6.3多重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn) 分別以PSV、TGEV、PDCoV、PEDV、CSFV、PRRSV的cDNA 和PPV、PRV、PCV-2的DNA為模板,用1.6.2確定后的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照,判斷該方法的特異性。

1.6.4多重RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏性試驗(yàn) 將4種陽(yáng)性質(zhì)?；旌?進(jìn)行10倍倍比稀釋,以稀釋后的混合陽(yáng)性質(zhì)粒(109～100拷貝/μL)為模板,用1.6.2確定后的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,評(píng)價(jià)該方法的靈敏性。

1.6.5多重RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn) 分別以104拷貝/μL的混合陽(yáng)性質(zhì)粒和4種單一陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,用1.6.2確定后的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,重復(fù)3次(每間隔3 d重復(fù)1次),評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.6.6臨床樣品檢測(cè) 對(duì)采集的48份臨床病料進(jìn)行預(yù)處理,糞便用DMEM稀釋,進(jìn)行震蕩,在4℃離心機(jī)中離心;對(duì)于腸道組織的處理,在EP管中依次加入小鋼珠、DMEM和黃豆大小的組織塊,再在機(jī)器上進(jìn)行碾磨,于4℃離心機(jī)中離心(5 000 r/min,10 min),取上清,用TRIzol 裂解法對(duì)樣品中的RNA進(jìn)行提取,反轉(zhuǎn)錄cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用建立的多重RT-PCR和單一RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果及陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定分別以PDCoV、PEDV、TGEV、PSV 4種病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,用1.5中的反應(yīng)體系和條件,進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示,均擴(kuò)增出與目的片段大小一致的條帶(圖1),將質(zhì)粒送往相關(guān)公司進(jìn)行測(cè)序,序列比對(duì)均正確,表明成功構(gòu)建了4種病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒。

M.DL700 DNA Marker;1～4:PDCoV、PEDV、TGEV、PSV;N.陰性對(duì)照

2.2 多重RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化通過(guò)對(duì)不同退火溫度(圖2)和4種引物不同濃度的組合(圖3)進(jìn)行篩選,確定多重PCR的反應(yīng)體系為2×Taq DNA Master Mix 15.00 μL,PSV-F/R(10 μmol/L)各0.50 μL,TGEV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,PDCoV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,PEDV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,cDNA為2.00 μL,補(bǔ)水至25.00 μL。最終確定的反應(yīng)條件為95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,4℃結(jié)束反應(yīng)。

2.3 多重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)分別以PSV、TGEV、PDCoV、PEDV、CSFV、PRRSV的cDNA 以及PPV、PRV、PCV-2的DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果顯示,該方法能夠擴(kuò)增出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的目的基因,同時(shí)與CSFV、PRRSV、PPV、PRV、PCV-2無(wú)交叉反應(yīng),證明該方法特異性良好(圖4)。

M.DL700 DNA Marker;1～6.退火溫度依次為50,52,54,56,58,60℃;N.陰性對(duì)照

M.DL700 DNA Marker;1～3.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.25 μmol/L,PSV為0.25,0.50,0.75 μmol/L;4～6.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.50 μmol/L,PSV為0.25,0.50,0.75 μmol/L;7～9.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.75 μmol/L,PSV引物終濃度依次為0.25,0.50,0.75 μmol/L;N.陰性對(duì)照

M.DL700 DNA Marker;1.混合的4種陽(yáng)性質(zhì)粒;2～5.PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽(yáng)性質(zhì)粒;6～10.PRV、PCV、PPV、PRRSV、CSFV;N.陰性對(duì)照

2.4 多重RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏性試驗(yàn)將同一濃度的4種陽(yáng)性質(zhì)?；旌?進(jìn)行10倍倍比稀釋,以稀釋后的陽(yáng)性質(zhì)粒(109～100拷貝/μL)為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,該檢測(cè)方法對(duì)PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的靈敏性分別為1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷貝/μL(圖5),證明本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法靈敏性較高。

M．DL700 DNA Marker;1～10.依次為109～100 拷貝/μL陽(yáng)性質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增;N.陰性對(duì)照

2.5 多重RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)分別以104拷貝/μL的混合陽(yáng)性質(zhì)粒和4種單一陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,重復(fù)3次(每間隔3 d重復(fù)1次)。結(jié)果顯示,該方法重復(fù)性良好(圖6)。

2.6 臨床樣品檢測(cè)利用建立的檢測(cè)方法對(duì)收集的48份臨床病料進(jìn)行檢測(cè),多重RT-PCR檢測(cè)出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽(yáng)性樣品分別有2,0,7,11份,單一RT-PCR檢測(cè)出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽(yáng)性樣品分別有3,2,9,12份,2種檢測(cè)方法的總符合率為91.66%(表2)。選擇了2個(gè)陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,通過(guò)同源性分析,發(fā)現(xiàn)6#陽(yáng)性樣品的基因序列與參考PEDV毒株序列同源性范圍在98.7%～99.1%之間(表3),29#陽(yáng)性樣品的基因序列與參考PDCoV毒株序列同源性范圍在99.1%～100.0%之間(表4),測(cè)序結(jié)果證明該檢測(cè)方法可特異性擴(kuò)增出病毒的目的基因。本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法可用于臨床上對(duì)PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的檢測(cè)。

A.第1次;B.第2次;C.第3次。M.DL700 DNA Marker;1.混合的4種陽(yáng)性質(zhì)粒;2～5.PSV、TGEV、PDCoV、PEDV各單一陽(yáng)性質(zhì)粒;N.陰性對(duì)照

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

表3 PEDV同源性分析 %

表4 PDCoV同源性分析 %

3 討論

豬腹瀉病毒在我國(guó)流行時(shí)間長(zhǎng),造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。PSV、TGEV、PDCoV、PEDV均可引起豬腸道腹瀉,臨床癥狀相似,難以區(qū)分。目前檢測(cè)方法有病毒分離、ELISA、q-PCR、RT-PCR、RPA等。病毒分離培養(yǎng)對(duì)試驗(yàn)操作要求比較高,需要用特定的細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行分離培養(yǎng),耗時(shí)長(zhǎng),同時(shí)要求無(wú)菌環(huán)境,不適用于臨床快速診斷。ELISA是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特性進(jìn)行檢測(cè),但由于需要制備專一的抗體,花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),在檢測(cè)過(guò)程中速度較慢,操作步驟較多不適用于快速檢測(cè)。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以在某個(gè)恒定溫度下大量擴(kuò)增病毒核酸,相比于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),無(wú)需改變樣品溫度,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果可視化,由于對(duì)引物和靶標(biāo)序列的選擇性要求比較高,導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受限制。多重RT-PCR可一次性檢測(cè)多種病毒,同時(shí)成本和操作技術(shù)相對(duì)較低。因此,多重RT-PCR在檢測(cè)病毒混合感染方面應(yīng)用比較廣泛。

本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法,基于PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的保守片段設(shè)計(jì)了4對(duì)引物。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,引物的設(shè)計(jì)是至關(guān)重要,首先對(duì)設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行篩選,保證引物之間不會(huì)出現(xiàn)同源性和互補(bǔ)現(xiàn)象,對(duì)篩選出的引物進(jìn)行比對(duì),要初步確保依據(jù)該引物建立的檢測(cè)方法具有良好特異性;驗(yàn)證單個(gè)引物能否擴(kuò)增出目的片段,再通過(guò)篩選出的引物進(jìn)行組合,看能否同時(shí)擴(kuò)增出4種病毒的目的片段,接著摸索最佳引物濃度以及退火溫度,建立豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法可擴(kuò)增出PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的目的基因,對(duì)CSFV、PRRSV、PPV、PRV和PCV-2無(wú)交叉反應(yīng),該方法特異性良好。韋學(xué)雷等[14]針對(duì)TGEV、PDCoV和PEDV建立的三重RT-PCR檢測(cè)方法,對(duì)TGEV、PDCoV和PEDV的檢測(cè)限分別為3.68×102,3.14×103和3.88×104拷貝/μL。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的檢測(cè)限分別為1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷貝/μL,比上述檢測(cè)方法靈敏度高。

利用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)臨床上收集的48份樣品進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)出2份PSV、7份PDCoV和11份PEDV,與單重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的總符合率為91.66%。根據(jù)臨床檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)中PEDV感染率最高,并且還存在著病毒混合感染的現(xiàn)象,2份病料呈現(xiàn)PSV和PDCoV混合感染,3份病料呈現(xiàn)PEDV和PDCoV混合感染。通過(guò)對(duì)其中2份陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)6#樣品和29#樣品分別為PEDV感染和PDCoV感染,與檢測(cè)結(jié)果相符合。

綜上所述,本試驗(yàn)成功建立用于檢測(cè)PSV、TGEV、PDCoV和PEDV 4種豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法,該方法具有良好的特異性和靈敏性,為臨床上對(duì)這4種病毒的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)保障。