影響透明質(zhì)酸炎癥反應的因素：雜質(zhì)、細胞種類和分子量大小

孫欣 王瑞妍

關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；炎癥；雜質(zhì)；細胞種類；分子量

透明質(zhì)酸是一種天然的直鏈聚合物，屬于糖胺聚糖的一種，是細胞外基質(zhì)的重要組成部分[1]。它由D- 葡萄糖醛酸和N- 乙?；?D- 葡萄糖胺的重復二糖單元組成，通過交替的β-1，3 和β-1，4 糖苷鍵連接，具有親水性[2]。在其天然形式中，透明質(zhì)酸一般表現(xiàn)為非常長的聚合物，稱為高分子量透明質(zhì)酸。在某些條件下，高分子量透明質(zhì)酸可以被分解成小片段，稱為低分子量透明質(zhì)酸[3]。各種研究文獻對于劃定透明質(zhì)酸分子量高低并無明確的界限，本文以不同分子量可能介導不同的炎癥反應為依據(jù)[4]，認為高分子量透明質(zhì)酸大于500 kDa，低分子量透明質(zhì)酸分子量為10 ～ 500kDa，而小于10kDa 則為寡聚透明質(zhì)酸。

對于低分子量透明質(zhì)酸和寡聚透明質(zhì)酸是否有促炎作用已經(jīng)引發(fā)了廣泛的關(guān)注和爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，在受到刺激后的巨噬細胞中加入不同分子量大小的透明質(zhì)酸后，并不能檢測到任何促炎癥因子、一氧化氮和α 型腫瘤壞死因子（TNF-α） 的產(chǎn)生[5]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，低分子量和高分子量透明質(zhì)酸并不會引起腎小球系膜細胞的炎癥反應；但如果采用透明質(zhì)酸酶來處理加入的透明質(zhì)酸并使之降解，則會使透明質(zhì)酸覆蓋的細胞膜表面炎癥因子受體（如TOLL 樣受體） 暴露出來，使得細胞更容易受到促炎分子（如內(nèi)毒素） 的影響[6]。此外，將低分子量透明質(zhì)酸（200kDa） 或人重組透明質(zhì)酸酶加入無內(nèi)毒素的透明質(zhì)酸中，兩者之一施用到小鼠皮下氣囊中后，并不會在灶點引發(fā)炎癥反應[7]。以上這些結(jié)果均不支持低分子量或寡聚透明質(zhì)酸具有促炎作用的觀點。

另外，透明質(zhì)酸或其他試劑中的雜質(zhì)或污染物，被發(fā)現(xiàn)可能導致實驗給出誤導性的結(jié)果。例如低至5 pg/mL的微量內(nèi)毒素就可以誘導小鼠樹突狀細胞產(chǎn)生促炎性的白細胞介素-6（IL-6）[8]。目前，有兩種生產(chǎn)工藝可用于獲得商業(yè)化的透明質(zhì)酸：從動物組織中提取，或者通過生物合成的方式獲得。這兩種方法都面臨著使用源自動物或鏈球菌的生物制品安全性問題，而鏈球菌作為一種已知的病原體，會產(chǎn)生內(nèi)毒素，成為透明質(zhì)酸的潛在污染源[9]。其他研究者也指出，透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶（如牛源或溶透明質(zhì)酸鏈霉菌源等） 是兩個很容易被內(nèi)毒素污染且被廣泛用于透明質(zhì)酸炎癥反應研究的試劑[10，11]。透明質(zhì)酸酶被用于各種分子量透明質(zhì)酸的降解以獲得小分子片段。如果不對最終測試物質(zhì)進行內(nèi)毒素控制和檢測，促進炎癥的結(jié)果就可能是由內(nèi)毒素而非透明質(zhì)酸導致。如此一來，結(jié)論就存在被誤導的風險。已有研究證實，不含內(nèi)毒素的、由外源性添加的各種分子量透明質(zhì)酸或者片段化透明質(zhì)酸在離體小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞中均不能引發(fā)促炎反應[11]。

本文將基于透明質(zhì)酸介導炎癥反應的機理，探究雜質(zhì)、細胞種類和分子量大小對透明質(zhì)酸介導炎癥反應的影響。

01透明質(zhì)酸介導炎癥反應的機理

透明質(zhì)酸根據(jù)兩種基本機制發(fā)揮其生物功能：（I）作為細胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)分子和（II）作為信號分子[12]。

高分子量透明質(zhì)酸作為細胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)分子，由于其大分子尺寸、顯著的吸濕性，能夠調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的組織水合作用和滲透平衡，構(gòu)建一個水合和穩(wěn)定的細胞外空間，在這里細胞、膠原蛋白以及其他細胞外基質(zhì)組分得到牢固的維持[11]。高分子量透明質(zhì)酸有助于維持細胞和組織的穩(wěn)態(tài)。

而當透明質(zhì)酸與結(jié)合分子相互作用時，它也起到信號分子的作用。與透明質(zhì)酸相關(guān)的結(jié)合分子主要有兩種：CD44 和CD168 （也稱RHAMM，即透明質(zhì)酸介導的運動受體）[13]。其他被發(fā)現(xiàn)的相關(guān)結(jié)合分子還包括細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、透明質(zhì)酸內(nèi)吞受體（HARE）、淋巴管內(nèi)皮受體-1（LYVE1）、TOLL 樣受體-2（TLR2） 和TOLL 樣受體-4（TLR4） 等[11，14]。

CD44 作為一種淋巴細胞黏附受體，被廣泛表達在各種免疫細胞表面，參與機體的炎癥反應，炎癥相關(guān)的細胞增殖、黏附和遷移，以及血管生成和細胞骨架重排[15]。透明質(zhì)酸與CD44 的結(jié)合力隨著透明質(zhì)酸分子鏈變長而增加[16]，而當透明質(zhì)酸的單糖數(shù)量低于20 個，與CD44 的結(jié)合方式便會發(fā)生變化[17]。透明質(zhì)酸通過與CD44 結(jié)合，在細胞表面形成覆蓋膜，該保護層能夠掩蓋住細胞的免疫受體，從而屏蔽掉炎癥因子，防止細胞凋亡[3]。

CD168 存在于細胞表面、細胞質(zhì)和細胞核中。細胞外側(cè)的CD168 與蛋白酪氨酸激酶受體（RTKs） 和非蛋白酪氨酸激酶受體（包括CD44 和CD44-EGFR 復合物） 相互作用，通過激活ERK1/2/MAPK 信號通路介導炎癥反應[12]。透明質(zhì)酸與CD44 和CD168 的相互作用可以誘導多種細胞行為，包括激活酪氨酸激酶、蛋白激酶C、FAK和PI3K、MAPK、NF-κB 和RAS，以及激活炎癥反應所需的細胞骨架成分[12]。上述細胞行為也可以由CD44 和CD168 各自獨立地與透明質(zhì)酸相互作用完成[12]。

此外，透明質(zhì)酸還可以與特定的細胞因子相互作用，從而調(diào)節(jié)免疫細胞功能。一個例子是白細胞介素-8（IL-8），它在炎癥存在時由成纖維細胞、單核細胞/ 巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞釋放。透明質(zhì)酸與IL-8 具有較弱的結(jié)合力，會降低IL-8 的活性。這意味著透明質(zhì)酸可以適當屏蔽掉IL-8 引發(fā)的免疫反應[18]。

02影響透明質(zhì)酸介導炎癥反應的因素

影響透明質(zhì)酸介導炎癥反應的因素，已有研究報道的包括：透明質(zhì)酸的分子量大小[19]，透明質(zhì)酸內(nèi)毒素的含量[10][20]、細胞受刺激的狀態(tài)[19]，以及各種細胞種類。

本文對透明質(zhì)酸在細胞層面的炎癥測試文獻進行了梳理，選擇促炎因子（如TNF-α） 和抑炎因子作為衡量指標，通過匯總透明質(zhì)酸對兩者是否有顯著的促進或者抑制作用，從而判斷各個因素對透明質(zhì)酸介導炎癥反應的影響。

2.1 細胞類型對于透明質(zhì)酸炎癥反應的影響

表 1 總結(jié)了免疫細胞（巨噬細胞和外周血單個核細胞）、角質(zhì)細胞和成纖維細胞，在正常條件和受刺激條件下，透明質(zhì)酸介導的炎癥反應。具體的數(shù)據(jù)匯總參見表 2 ～表7。很明顯，不同細胞類型下，透明質(zhì)酸呈現(xiàn)出不同的炎癥反應。比如，角質(zhì)細胞對各種分子量的透明質(zhì)酸都不會產(chǎn)生促炎反應，而這些透明質(zhì)酸在正常的成纖維細胞中卻很可能引發(fā)炎癥反應。值得一提的是，由于寡聚透明質(zhì)酸對正常角質(zhì)細胞沒有炎癥反應，而對于炎癥狀態(tài)的角質(zhì)細胞（比如紫外刺激后） 能減緩炎癥反應，因此可能很適合用來涂抹在皮膚表面，用于抗炎修復。

2.2 內(nèi)毒素含量對于透明質(zhì)酸炎癥反應的影響

內(nèi)毒素也被稱為脂多糖（LPS），它是所有革蘭氏陰性細菌細胞壁的內(nèi)源性成分，對大多數(shù)哺乳動物都有“毒性”作用。LPS 是一種非常有效的炎癥反應刺激物，在微克/升的濃度范圍內(nèi)即可以有生物活性[25，26]。大量關(guān)于寡聚、低分子或者片段透明質(zhì)酸具有促炎作用的文章都是基于透明質(zhì)酸降解實驗，而降解過程中被廣泛使用的試劑（如透明質(zhì)酸酶） 或方法容易被內(nèi)毒素污染，但一些研究并沒有對降解后透明質(zhì)酸的內(nèi)毒素進行控制或檢測，這使得所謂寡聚、低分子或者片段透明質(zhì)酸具有促炎作用時常缺少說服力[27-29]。

內(nèi)毒素會產(chǎn)生促炎癥反應是公認的事實。根據(jù)美國FDA 要求，每件非特殊移植性醫(yī)療器械的內(nèi)毒素上限是20 EU。目前各大透明質(zhì)酸供應商都會嚴格控制內(nèi)毒素含量，使之處于安全上限以下。表8 列出了已被報道的透明質(zhì)酸介導炎癥反應與內(nèi)毒素含量的關(guān)系，由于此處內(nèi)毒素含量是上限，實際透明質(zhì)酸的內(nèi)毒素含量可能遠低于展示的數(shù)值，這使得分析內(nèi)毒素含量與透明質(zhì)酸介導炎癥反應的關(guān)系變得困難和不甚可靠。表8 里列出的最低內(nèi)毒素上限是0.01EU/mg；在此上限下，依舊發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸不論分子量大小，都存在促炎反應。另外，從機理上說，相比較高分子量透明質(zhì)酸，低分子量透明質(zhì)酸更加無法覆蓋和屏蔽細胞膜上的促炎因子受體，因此相同含量的內(nèi)毒素在低分子量透明質(zhì)酸下可能會更容易觸發(fā)細胞的炎癥反應。有研究發(fā)現(xiàn)，低分子量透明質(zhì)酸對LPS 處理的軟骨細胞有增強炎癥因子產(chǎn)生的作用，中等分子量透明質(zhì)酸對LPS處理的軟骨細胞產(chǎn)生炎癥因子沒有影響，而高分子量透明質(zhì)酸對LPS 處理的軟骨細胞能夠降低炎癥反應[30]。

表8 所示為不同的透明質(zhì)酸內(nèi)毒素含量下，加入透明質(zhì)酸和不加透明質(zhì)酸后，細胞促炎因子（或相關(guān)mRNA 表達） 的變化和抑炎因子（或相關(guān)mRNA 表達） 的變化。

03結(jié)論

透明質(zhì)酸介導的炎癥反應，既與透明質(zhì)酸本身的類型和純度相關(guān)，也與試驗研究所用的細胞類型等實驗條件相關(guān)。

在角質(zhì)細胞、外周血單個核細胞、星形膠質(zhì)細胞[31] 等細胞模型中，無論分子量大小，透明質(zhì)酸都不會促發(fā)炎癥反應。寡聚透明質(zhì)酸對于UVB 損傷的角質(zhì)細胞還具有減輕炎癥反應的作用。而在成纖維細胞、巨噬細胞、軟骨細胞[20][32][38]、人細支氣管上皮細胞[33] 等細胞模型下，透明質(zhì)酸介導炎癥反應則復雜得多。通過整理分析巨噬細胞相關(guān)的論文發(fā)現(xiàn)，似乎高分子量透明質(zhì)酸更傾向于抑制炎癥，而低分子量透明質(zhì)酸則更容易加劇炎癥反應。但是也有研究表明寡聚和低分子量透明質(zhì)酸并沒有促炎作用[34，35]。巨噬細胞不同的極化（或激活） 狀態(tài)對透明質(zhì)酸會產(chǎn)生不一樣的反應[19]。許多刺激物（如LPS 或干擾素γ） 具有激活巨噬細胞的能力，但即使是具有大致相同表型的刺激物（LPS 或干擾素γ 與LPS） 也會導致不同的細胞激活狀態(tài)，進而影響數(shù)據(jù)結(jié)果。諸多巨噬細胞實驗之所以會產(chǎn)生各自矛盾的結(jié)論，實驗模型的差異可能是其中一個很重要的原因。

內(nèi)毒素作為一種容易混入透明質(zhì)酸的雜質(zhì)在商業(yè)化生產(chǎn)中已經(jīng)可以被很好地控制在安全上限以下。從發(fā)表的研究來看，在使用商業(yè)化的透明質(zhì)酸所做的實驗中，并沒有證據(jù)表明內(nèi)毒素含量與透明質(zhì)酸介導的炎癥反應存在相關(guān)性。但是也有研究表明，相同含量的內(nèi)毒素在較低分子量的透明質(zhì)酸中更容易刺激細胞產(chǎn)生炎癥反應。因此，對低分子量或寡聚透明質(zhì)酸進行更嚴格的內(nèi)毒素控制顯得很有必要。