微流控技術(shù)在化妝品安全與功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

葉潔忺 張靜 張子霖 沙利烽 葛健軍 陳早早 張娟 顧忠澤

關(guān)鍵詞：化妝品；微流控技術(shù)；生物傳感器；皮膚芯片；安全性；功效性

01前言

隨著科技的發(fā)展以及人們對(duì)化妝品需求的增加，成分更復(fù)雜、功能更多樣化的化妝品應(yīng)運(yùn)而生，檢驗(yàn)化妝品安全性、功效性的重要性不言而喻。歐盟消費(fèi)者安全科學(xué)委員會(huì)（SCCS） 在《化妝品成分測(cè)試及其安全性評(píng)估指南注釋》中提出了化妝品成分和產(chǎn)品的安全性評(píng)估，要求包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏、皮膚吸收、慢性毒性等多項(xiàng)研究[1]。

微流控技術(shù)是一項(xiàng)綜合性很強(qiáng)的多學(xué)科技術(shù)，具有在微米尺度上對(duì)流體進(jìn)行精確控制和操縱的能力[2]，與傳統(tǒng)基于實(shí)驗(yàn)室的宏觀技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于樣本量小、高通量、低成本、高靈敏度。通過(guò)微流控技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)、組織工程技術(shù)、生物傳感技術(shù)的融合，其在化妝品安全與功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用潛力不容忽視。

02理化檢測(cè)應(yīng)用

生物傳感器是一種將生物識(shí)別元件和生物材料與物理傳感器結(jié)合來(lái)轉(zhuǎn)換生物反應(yīng)，以產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的分析裝置，微流控裝置具有可移動(dòng)性、操作透明性、可控性、準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)[3，4]。結(jié)合微流體技術(shù)的生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)更快的處理和更高的效率，它們?cè)诨瘖y品檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用，如化妝品的有毒元素檢測(cè)、活性物質(zhì)檢測(cè)等[5]。

2.1 重金屬檢測(cè)

在化妝品中，為了達(dá)到美白效果，經(jīng)常添加汞，一旦過(guò)量，就會(huì)對(duì)皮膚和器官造成慢性毒性[6]。Chao Wu 等人[7] 開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速和可視化的Hg2+ 檢測(cè)策略。當(dāng)Hg2+存在時(shí)，探針可以轉(zhuǎn)化為G- 四聯(lián)體DNA，并與血紅蛋白結(jié)合形成DNA 酶，DNA 酶與沉淀的TMB 反應(yīng)，在紙上產(chǎn)生可見(jiàn)的色帶，色帶長(zhǎng)度與Hg2+ 濃度呈正相關(guān)。該傳感器不僅能檢測(cè)汞離子，并具有良好的再現(xiàn)性和滿(mǎn)意的動(dòng)態(tài)范圍，檢出限低至0.23 nM。該方法不僅提供了Hg2+ 的可視化快速篩查，而且可應(yīng)用于其他金屬離子的即時(shí)檢測(cè)。

2.2 微生物檢測(cè)

化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)化妝品微生物污染是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。被污染的微生物可能產(chǎn)生一些代謝物，刺激皮膚炎癥或過(guò)敏反應(yīng)。因此，規(guī)范有效的化妝品質(zhì)量監(jiān)督管理十分重要[5]。

Peng Zuo 等人[8] 發(fā)明了一種聚二甲基硅氧烷（PDMS）/ 紙/ 玻璃混合微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于集成的適配體功能化氧化石墨烯生物傳感器，無(wú)需樣本制備程序，可直接檢測(cè)病原微生物。該微流體生物傳感器裝置只需10 分鐘即可完成金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，大大縮短檢測(cè)周期，并且在快速檢測(cè)各種不同的其他細(xì)菌和病毒病原體方面具有很大的潛力。

2.3 抗生素檢測(cè)

化妝品中的抗生素主要有甲硝唑、氯霉素、氧氟沙星等，能抑制皮膚微生物，增強(qiáng)皮膚抵抗細(xì)菌感染的能力，達(dá)到表面保護(hù)皮膚的效果。但長(zhǎng)期使用含抗生素的化妝品會(huì)引起接觸性皮炎等不良反應(yīng)，如紅斑、水腫、滲出、灼燒等，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性增加，降低治療效果[9，10]。

André Kling[11] 等人構(gòu)建了一個(gè)可在臨床相關(guān)樣品中同時(shí)進(jìn)行多重分析的電化學(xué)檢測(cè)的微流控平臺(tái)，能實(shí)現(xiàn)不同酶聯(lián)分析的同時(shí)電化學(xué)讀數(shù)，檢測(cè)八種不同的分析物。該裝置可在15 分鐘內(nèi)使用高靈敏度的生物分子傳感器系統(tǒng)，同時(shí)完成樣本中四環(huán)素和鏈球菌素這兩種常用抗生素的檢測(cè)。

03體外皮膚模型

2019 年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局正式宣布從2035 年起不再支持使用哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行安全性測(cè)試的研究[12]。基于相關(guān)法律法規(guī)的頒布和大家對(duì)“3R” 原則（reduction，replacement， refinement） 的關(guān)注，建立穩(wěn)定的體外皮膚模型以減少化妝品行業(yè)中傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)十分必要。

體外皮膚模型自20 世紀(jì)40 年代起開(kāi)始大力發(fā)展。1948 年，首次出現(xiàn)對(duì)體外培養(yǎng)成年哺乳動(dòng)物皮膚上皮的描述；1975 年，使用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的2D 皮膚模型出現(xiàn)；1976 年，第一個(gè)體外3D 皮膚模型出現(xiàn)，它更加接近了皮膚的自然結(jié)構(gòu)和功能；隨后出現(xiàn)了更多不同類(lèi)型的人類(lèi)皮膚等效物[13–19]。直至今日，已經(jīng)發(fā)展出多種可用于化妝品安全性和功效性評(píng)價(jià)的功能化皮膚模型，其在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用前景十分廣闊。

3.1 皮膚芯片

皮膚芯片（skin-on-a-chip） 是在微流控體系中培養(yǎng)皮膚組織，通過(guò)控制大量物理、生物化學(xué)參數(shù)如培養(yǎng)基流動(dòng)、機(jī)械力、生物化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度等模擬真實(shí)人體皮膚的三維培養(yǎng)微環(huán)境，從而制造具有皮膚層級(jí)結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)的功能化的三維皮膚組織[20]。微流控設(shè)備的主要優(yōu)點(diǎn)是流體流動(dòng)和對(duì)微環(huán)境的精細(xì)控制，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，微流控系統(tǒng)可以精確控制各種參數(shù)，如機(jī)械力、介質(zhì)流量和生物化學(xué)的梯度，改善細(xì)胞分化、形態(tài)、功能、細(xì)胞- 細(xì)胞和細(xì)胞- 基質(zhì)相互作用，在皮膚芯片中集成成熟皮膚層和皮膚附屬器官，且使其具有屏障功能[21–23]。

典型的皮膚芯片包括一個(gè)transwell 支架或一層多孔膜，將皮膚模型與底層灌注的培養(yǎng)基分開(kāi)，允許藥物或細(xì)胞因子等大分子擴(kuò)散到皮膚模型中[24]。皮膚組織通常是由原代來(lái)源分離的細(xì)胞、干細(xì)胞分化的皮膚細(xì)胞或從活檢組織中獲得的皮膚所制造的[24]。主要相關(guān)細(xì)胞有角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，也包括內(nèi)皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、免疫細(xì)胞等其他細(xì)胞，以及部分附屬器官，例如血管、毛囊等[25，26]。

皮膚芯片應(yīng)用于化妝品行業(yè)的優(yōu)勢(shì)不僅在于其更加還原人體真實(shí)皮膚結(jié)構(gòu)，還能進(jìn)行形態(tài)、活性、生化指標(biāo)以及屏障功能、滲透性等皮膚特定功能檢測(cè)，并支持在芯片上集成多種原位生物傳感器，以提供更豐富的功能，如實(shí)時(shí)皮膚功能檢測(cè)和藥物動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[27]。

3.2 安全性評(píng)估

在新的化妝品成分投放市場(chǎng)之前，需要對(duì)其安全性進(jìn)行多方面評(píng)估，包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏等，皮膚芯片在安全性評(píng)估中主要用于皮膚致敏和皮膚刺激試驗(yàn)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

3.2.1 毒理學(xué)評(píng)估

Jong Seung Lee 等人[28] 報(bào)道了一種能夠?qū)λ幬锖突瘖y品化合物進(jìn)行詳細(xì)毒理學(xué)評(píng)估的混合人體皮膚芯片（ 見(jiàn)圖1a）。該研究構(gòu)建的皮膚—神經(jīng)和皮膚—肝臟混合模型可以與代表性的分析方法相結(jié)合，如鈣成像檢測(cè)神經(jīng)元活性、GSH/ROS 檢測(cè)肝毒性，以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量皮膚致敏分析和皮膚施用化學(xué)物質(zhì)的潛在肝毒性評(píng)估，有助于定量評(píng)估皮膚施用化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)效應(yīng)。

3.2.2 化學(xué)刺激評(píng)估

Jing Zhang 等人[29] 構(gòu)建了一種直接在微流控芯片內(nèi)培養(yǎng)和分化人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的高仿真表皮芯片（見(jiàn)圖1b）， 主要通過(guò)細(xì)胞毒性對(duì)10 種已知毒素和非毒素的化學(xué)品進(jìn)行體外刺激評(píng)價(jià)，且對(duì)刺激反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估，如炎癥細(xì)胞因子釋放等。檢測(cè)結(jié)果表明，該皮膚芯片是體外皮膚刺激評(píng)估的潛在替代方案。同時(shí)，該系統(tǒng)還集成了TEER 傳感器，可為后續(xù)檢測(cè)提供便利。

3.3 功效評(píng)價(jià)

3.3.1 有效成分篩選

在開(kāi)發(fā)化妝品的過(guò)程中，需要花費(fèi)大量時(shí)間用于篩選有效活性成分及其組合。Zhengkun Chen 等人[30] 構(gòu)建了一個(gè)在仿生和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)大量真皮成纖維細(xì)胞球體（dermal fibroblast sphere，DFS）的微流控平臺(tái)（見(jiàn)圖2）。該團(tuán)隊(duì)先在芯片上培養(yǎng)形成DFS，再探究不同劑量的維生素C 對(duì)DFS 生產(chǎn)I 型膠原蛋白和纖維連接蛋白的影響，實(shí)現(xiàn)在3 天內(nèi)高效篩選維生素C 對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響。概念驗(yàn)證設(shè)計(jì)中，可以在單個(gè)芯片上實(shí)現(xiàn)12 種不同的成分或成分組合的高通量篩選，大大提高有效成分篩選的工作效率，縮短化妝品研發(fā)周期。

3.3.2 透皮吸收評(píng)價(jià)

在化妝品開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，化妝品通過(guò)皮膚屏障的滲透能力十分關(guān)鍵，需要對(duì)化妝品及其活性成分進(jìn)行透皮吸收進(jìn)行測(cè)試。相比于傳統(tǒng)的Franz 細(xì)胞擴(kuò)散法，使用皮膚芯片檢測(cè)不僅能規(guī)避倫理問(wèn)題和物種差異，也能更好地模擬皮膚微循環(huán)，得到更有效的數(shù)據(jù)。

Gopu Sriram 等人[31] 設(shè)計(jì)了一種用于全層人體皮膚的集成培養(yǎng)和測(cè)試的新型微流控裝置（見(jiàn)圖3a）。皮膚模型可以直接在設(shè)備中重建，并支持對(duì)其進(jìn)行滲透和毒性研究。通過(guò)TEER 評(píng)價(jià)了皮膚組織的完整性，并通過(guò)滲透性實(shí)驗(yàn)比較了化合物咖啡因在皮膚芯片模型和靜態(tài)皮膚模型中的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)證明，該裝置能顯著提高皮膚模型的質(zhì)量和功能，并具有在同一平臺(tái)上進(jìn)行皮膚安全和滲透測(cè)試等下游檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)（ 見(jiàn)圖3b）。

Varga-Medveczk 等人[32] 所開(kāi)發(fā)的微流控?cái)U(kuò)散室（Microfluidic Diffusion Chamber，MDC） 可用于局部化妝品經(jīng)皮吸收的體外/ 離體監(jiān)測(cè)，并可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行部分改裝。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，將含咖啡因的乳膏放置在微芯片供體隔室中，并使用外周灌注，將人工皮膚中與人體皮膚中的咖啡因轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示出相似的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)和良好的再現(xiàn)性。另外還研究了兩種p 糖蛋白底物紅霉素和奎尼丁在p 糖蛋白抑制劑PSC-833 存在和不存在情況下的透皮滲透曲線。以上實(shí)驗(yàn)表明，MDC 系統(tǒng)可用于研究皮膚芯片微流控系統(tǒng)與透皮成分傳遞和真皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用，在化妝品透皮吸收評(píng)價(jià)中很有應(yīng)用價(jià)值。

3.3.3 抗衰評(píng)價(jià)

體內(nèi)衰老是由人體的代謝過(guò)程所引起的，外表老化與長(zhǎng)期暴露于紫外線及其他環(huán)境因素有關(guān)[33]。人們期望使用化妝品達(dá)到預(yù)防或逆轉(zhuǎn)皮膚老化的效果，以保持年輕健康的皮膚外觀。因此有很多關(guān)于皮膚老化及抗衰老的研究正在不斷開(kāi)展[34，35]。

Subin Jeong 等人[36] 基于具有人類(lèi)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的全層三維皮膚的柔性皮膚芯片，使用光交聯(lián)劑和反映晝夜節(jié)律的機(jī)械刺激環(huán)境開(kāi)發(fā)老化皮膚模型（見(jiàn)圖4a，b）。在28 天的比較培養(yǎng)中，該模型全層皮膚當(dāng)量收縮減少，表皮層厚度減少，β- 半乳糖苷酶基因表達(dá)增加，記錄并證明了衰老的過(guò)程。這種新型芯片皮膚衰老模型的使用有望揭示新的衰老機(jī)制，可用于新的抗衰老物質(zhì)的篩選和功效測(cè)試，對(duì)抗衰老化妝品的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

Gun Yongo Sung[37] 等人利用其所在團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的基于無(wú)泵PDMS 芯片系統(tǒng)的全層皮膚芯片（ 見(jiàn)圖4c），檢測(cè)姜黃葉提取物（CLLE） 作為一種化妝品原料對(duì)皮膚抗衰老的作用，結(jié)果顯示50 μg/mL 的CLLE 作用后能顯著增強(qiáng)皮膚模型的屏障功能，并且從基因、蛋白水平均顯示絲聚蛋白、內(nèi)批蛋白的表達(dá)增高。此研究表明，該無(wú)泵皮膚芯片模型可以作為動(dòng)物研究的替代方案用于化妝品行業(yè)。

3.3.4 美白測(cè)試

黑色素的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致黃褐斑等皮膚疾病，色素沉著問(wèn)題也是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[38]。出于對(duì)美容和健康的雙重考慮，人們對(duì)美白化妝品的需求逐步增加，檢測(cè)化妝品的美白功效也成為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。

Qiwei Li 等人[39] 設(shè)計(jì)了一種可進(jìn)行半固體、固體物質(zhì)測(cè)試的三單元表皮芯片（ 見(jiàn)圖5a）。在芯片中培養(yǎng)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和正常人黑素細(xì)胞后，生成的穩(wěn)定黑色素表皮呈現(xiàn)出多層結(jié)構(gòu)，并具有屏障功能。該團(tuán)隊(duì)使用此表皮芯片測(cè)試了一種化妝品的美白效果，通過(guò)表征與分析證明了該化妝品在減少黑色素合成方面的功效（ 見(jiàn)圖5b）。同時(shí)還使用該表皮芯片測(cè)試了四種化學(xué)物質(zhì)的刺激和滲透特性。測(cè)試結(jié)果表明，該皮膚芯片可以為皮膚刺激或滲透的體外評(píng)估以及美容評(píng)估提供一種替代方法。

04總結(jié)與展望

隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，其在化妝品安全與功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用也更加豐富多樣。微流控技術(shù)和生物傳感器的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)對(duì)化妝品中的重金屬、微生物、抗生素進(jìn)行快速檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)特異性、靈敏度，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。但目前仍存在傳感器識(shí)別精度不夠準(zhǔn)確，穩(wěn)定性差，制備周期長(zhǎng)等問(wèn)題，還有待進(jìn)一步改進(jìn)。

此外，生物傳感器不能用于檢測(cè)化妝品中的所有物質(zhì)，如防腐劑等。

皮膚芯片結(jié)合了微流控、微傳感、組織工程等多種技術(shù)，能對(duì)真實(shí)人體皮膚進(jìn)行一定程度上的模仿，有望部分替代傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)。雖然目前已經(jīng)出現(xiàn)多種皮膚芯片，但皮膚芯片真正商業(yè)化還面臨著各種難題，如細(xì)胞類(lèi)型的缺失、皮膚附屬物的缺失、微血管的復(fù)制、皮膚表面微環(huán)境的構(gòu)建等等，故而還原人體皮膚的程度有限，仍需進(jìn)一步發(fā)展。2022 年12 月，我國(guó)第一個(gè)器官芯片國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《皮膚芯片通用技術(shù)要求》通過(guò)立項(xiàng)評(píng)審，將推進(jìn)該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展和行業(yè)規(guī)范化。總體來(lái)說(shuō)，皮膚芯片作為一項(xiàng)能集成多種原位生物傳感器、聯(lián)合多器官芯片的新興技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)多種化妝品評(píng)價(jià)方面的發(fā)展?jié)摿κ蔷薮蟮摹?/p>