國際化妝品原料遺傳毒性評(píng)估的關(guān)注點(diǎn)

文海若 柴學(xué)麗 吳輝 耿興超

化妝品原料進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)的背景介紹

化妝品是消費(fèi)者長期日常使用的產(chǎn)品，涉及各個(gè)年齡段。因此，安全作為化妝品研發(fā)的首要因素，受到研發(fā)單位和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的高度重視?！秶H化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)中文名稱目錄（2010 年版）》中已收錄了超過15000 種化妝品原料。國內(nèi)《已使用化妝品原料名稱目錄》中收載了近9000 種化妝品原料，目錄以外的化妝品原料視為新原料，經(jīng)過毒理學(xué)評(píng)估后方可使用。隨著動(dòng)物試驗(yàn)“3R”（reduction， replacement， refinement， 即動(dòng)物使用的減少、替代和優(yōu)化） 原則和替代理念的推廣，歐盟國家自2013 年3 月起全面禁止銷售經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品（含化妝品原料）。國際上，鼓勵(lì)使用更先進(jìn)的科學(xué)手段進(jìn)行化妝品的安全性評(píng)價(jià)，包括以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方式減少終產(chǎn)品的毒理學(xué)檢測(cè)，以及發(fā)展可靠的毒理學(xué)替代方法。

遺傳毒性試驗(yàn)用于檢測(cè)受試物是否存在誘導(dǎo)機(jī)體遺傳物質(zhì)損傷風(fēng)險(xiǎn)，從而預(yù)測(cè)受試物的致癌性。當(dāng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽性時(shí)，提示受試物為潛在的人體致癌劑或致突變劑。腫瘤的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，而單一遺傳毒性評(píng)價(jià)方法難以涵蓋多種檢測(cè)終點(diǎn)。故用于監(jiān)管的遺傳毒性數(shù)據(jù)，需來自評(píng)價(jià)終點(diǎn)互補(bǔ)的體外和體內(nèi)試驗(yàn)組合，以從多種角度對(duì)受試物的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》列出了6 項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)方法，并指出遺傳毒性試驗(yàn)項(xiàng)目至少包括1 項(xiàng)基因突變?cè)囼?yàn)和1 項(xiàng)染色體畸變?cè)囼?yàn)。其中，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）是首選的遺傳毒性試驗(yàn)，與體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)相結(jié)合，可檢出絕大多數(shù)導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物腫瘤的物質(zhì)，其檢測(cè)的靈敏性達(dá)74.3%[2]。

傳統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)化妝品原料時(shí)存在的問題

化妝品是由天然、合成或提取物質(zhì)作為原料經(jīng)調(diào)配加工而成的復(fù)配混合物，如油性原料、粉質(zhì)原料等?；瘖y品原料的性質(zhì)和有色成分可能對(duì)Ames 試驗(yàn)或體外染色體畸變?cè)囼?yàn)體系產(chǎn)生干擾。如化妝品成分中含有組氨酸或色氨酸成分，則可能在Ames 試驗(yàn)中得到假陽性結(jié)果。一些在體外哺乳動(dòng)物微核試驗(yàn)和染色體畸變?cè)囼?yàn)中檢測(cè)結(jié)果為陽性化學(xué)物質(zhì)（如芳香胺類），在相同檢測(cè)終點(diǎn)的體內(nèi)研究中并不具有遺傳毒性或致癌性[3]，其原因與體外試驗(yàn)系統(tǒng)缺乏體內(nèi)代謝補(bǔ)償機(jī)制有關(guān)。再如，微核試驗(yàn)結(jié)果易于受到pH 值和滲透壓的影響。此外，具有氧化作用機(jī)制的化合物在體外評(píng)價(jià)體系中易于得到假陽性結(jié)果。而過高的細(xì)胞毒性是導(dǎo)致體外細(xì)胞致裂性試驗(yàn)假陽性結(jié)果的另一主要因素[4]。此外，化妝品多以局部皮膚外用為主，體內(nèi)吸收和全身分布較少。如有潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)苯二胺人體經(jīng)皮吸收率僅為0.18%[5]，體外試驗(yàn)中通常選擇較高濃度受試物與細(xì)胞作用，試驗(yàn)結(jié)果與人體毒性外推存在較高不確定性。傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法在應(yīng)用于化妝品原料藥的評(píng)價(jià)時(shí)需進(jìn)行一定優(yōu)化。歐盟化妝品指令第7 次修訂（2003/15/EC） 已于2009 年3 月開始禁止對(duì)化妝品成分進(jìn)行體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)?；瘖y品公司考慮到排除體外試驗(yàn)陽性結(jié)果所需的時(shí)間和資源成本，往往會(huì)摒棄體外試驗(yàn)中得到陽性結(jié)果的化學(xué)品原料。目前的體外遺傳毒性試驗(yàn)研究重點(diǎn)在于如何提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并找到更加合適且有效的體外替代模型進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)[6]。

歐洲化妝品、盥洗用品和香水協(xié)會(huì)（EuropeanCosmetic .Toiletr y and Per fumer y A s sociation，COLIPA） 于2004 年成立了遺傳毒性研究小組，一方面對(duì)現(xiàn)有體外標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)方法進(jìn)行改良，從而減少假陽性結(jié)果；另一方面推進(jìn)新評(píng)價(jià)方法作為標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)結(jié)果為陽性的化合物的后續(xù)選擇。研究發(fā)現(xiàn)，假陽性結(jié)果主要來自II 相代謝酶活力不足的細(xì)胞系和p53 功能缺陷的細(xì)胞系，前者的解毒能力不足，后者DNA 修復(fù)功能較差。來自人源細(xì)胞（如人淋巴細(xì)胞、TK6 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞）的結(jié)果與傳統(tǒng)的CHL、CHO 或V79 相比，特異性更佳[7]。此外，細(xì)胞毒性過大可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，試驗(yàn)時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞毒性相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，以支持試驗(yàn)濃度設(shè)置的合理性。

近年來，隨著替代毒理學(xué)的興起和組織工程技術(shù)的應(yīng)用，三維（3 dimensions， 3D） 重組人工皮膚模型在化妝品毒性替代模型的研發(fā)中嶄露頭角。3D 重組皮膚模型使用人來源的皮膚組織構(gòu)建，試驗(yàn)周期較短，試驗(yàn)結(jié)果與人體毒性結(jié)果相比更具可比性和針對(duì)性。盡管目前研發(fā)的人體皮膚模型尚不包含毛囊、皮脂腺、神經(jīng)、循環(huán)和淋巴系統(tǒng)，研究數(shù)據(jù)與人體臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性還有待商榷，但極有可能在今后列入安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在監(jiān)管領(lǐng)域有重要前景。以下就人3D 重組皮膚模型在遺傳毒性評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景進(jìn)行闡釋。

3D 重組皮膚模型在化妝品原料遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

皮膚是人類最大的器官，由多種類型的細(xì)胞共同構(gòu)成阻擋有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的第一道天然屏障。首個(gè)體外表皮模型于20 世紀(jì)70 年代成功構(gòu)建，其初衷是解決臨床患者大面積皮膚損傷與缺失修復(fù)的瓶頸，之后逐漸應(yīng)用于體外化妝品安全性評(píng)價(jià)[8]。3D 重組皮膚模型將人皮膚細(xì)胞培養(yǎng)于特殊的插入式培養(yǎng)皿后得到，具有完整的3D 皮膚解剖結(jié)構(gòu)，從功能和結(jié)構(gòu)上模擬人體皮膚，在化妝品毒性評(píng)價(jià)中具有重要價(jià)值。因此，難溶的、膏狀和油脂類配方的受試物以涂抹的方式放到皮膚模型上，解決了體外試驗(yàn)中化妝品制劑性質(zhì)特殊的問題。此外，3D 皮膚模型可以提供毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)為毒理學(xué)數(shù)據(jù)分析提供支持。然而，因當(dāng)前模型不包含毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬結(jié)構(gòu)，且屏障功能低于真實(shí)皮膚，3D 模型試驗(yàn)中的經(jīng)皮吸收率通常高于真實(shí)人群使用情況[9]。今后應(yīng)著重研發(fā)與人體接近的、適合不同類產(chǎn)品評(píng)價(jià)需求的、穩(wěn)定的、可長期重復(fù)給藥的皮膚模型。

目前已應(yīng)用于遺傳毒性試驗(yàn)研究的商品化皮膚模型包括美國MatTek 的EpiDermTM 和Epi-200 和法國歐萊雅的EpiSkinTM。其中表皮模型主要用于微核試驗(yàn)，而全皮模型則更適用于靈敏度較高的彗星試驗(yàn)。

1. 微核試驗(yàn)

COLIPA 組織歐盟、美國及日本多家實(shí)驗(yàn)室開展基于EpiDermTM 的國際實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證，通過試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化、已知毒性受試物小范圍驗(yàn)證和大量受試物實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證逐步確認(rèn)試驗(yàn)方法及其復(fù)現(xiàn)性[10]。當(dāng)前已完成29 個(gè)受試物的大規(guī)模驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)EpiDermTM 的特異性達(dá)到88.1%，靈敏性達(dá)62.5%， 而一致性達(dá)到81%。比較EpiDermTM 和正常人表皮角化細(xì)胞對(duì)多種已知體內(nèi)非遺傳毒性及遺傳毒性化合物的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受試物不經(jīng)S9作用即可得到接近體內(nèi)的研究結(jié)果，與此同時(shí)EpiDermTM也可較好地排除因毒性引起的體外培養(yǎng)細(xì)胞假陽性結(jié)果[11]。Hu et al 也使用EpiDermTM 對(duì)7 種化合物開展驗(yàn)證并指出該模型可實(shí)現(xiàn)接近體內(nèi)研究的暴露條件，有效對(duì)染色體損傷風(fēng)險(xiǎn)作出預(yù)測(cè)[12]。近年來，EpiSkinTM 皮膚模型也陸續(xù)開展微核試驗(yàn)的驗(yàn)證工作，一項(xiàng)就17 種化合物的胞質(zhì)分裂阻斷法微核試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其用于評(píng)估化合物遺傳毒性的特異性、準(zhǔn)確性及一致性分別達(dá)到60～75%、83～85% 和76～82%，且72 小時(shí)長時(shí)間暴露于受試物的方式可有效提高遺傳毒性物質(zhì)的檢出率[13]。中國EpiSkinTM皮膚模型微核試驗(yàn)方法已于我國完成初步驗(yàn)證，結(jié)果顯示該模型的穩(wěn)定性和細(xì)胞增殖活力可滿足試驗(yàn)需求，并可確將陽性物質(zhì)長春新堿、N- 乙基-N- 亞硝基脲、3-丁內(nèi)酯、2-乙酰氨基芴和陰性物質(zhì)環(huán)己酮、2，4- 二氯苯酚的遺傳毒性進(jìn)行歸類，證明其具備一定預(yù)測(cè)能力，在今后將進(jìn)一步驗(yàn)證并推廣。MatTek 的Epi-200 皮膚模型也完成了歷時(shí)7 年的微核試驗(yàn)聯(lián)合驗(yàn)證[14]。美國和歐洲的4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)43個(gè)化合物的驗(yàn)證結(jié)果顯示，與體內(nèi)遺傳毒性結(jié)果相比，該模型總體準(zhǔn)確率為 80%，靈敏度為 75%，特異性為 84%；實(shí)驗(yàn)室間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重現(xiàn)性分別為 77% 和 84%。 此外，72h 暴露方案比48h 更為靈敏。當(dāng)前使用三D 皮膚模型微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為化妝品安全性監(jiān)管的資料已提交至歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European Centre for the Validationof Alternative Methods， ECVAM）。

2. 彗星試驗(yàn)

彗星試驗(yàn)主要用于預(yù)測(cè)受試物的DNA 反應(yīng)性，可與體外微核試驗(yàn)形成互補(bǔ)。COLIPA 已分階段使用EpiDermTM 開展體外彗星試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證工作。在第一階段和第二驗(yàn)證的工作中分別使用甲磺酸甲酯、4-硝基喹啉、乙?；鶃喯趸?、2，4- 二氨基甲苯、硝基苯酚、環(huán)己酮等對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該模型的復(fù)現(xiàn)性較好。然而溶劑組背景值過高（高于30%） 成為進(jìn)一步大規(guī)模驗(yàn)證的瓶頸。也有研究提示使用尚未發(fā)育完全的細(xì)胞模型EPI-201 可減少運(yùn)輸時(shí)長對(duì)皮膚模型質(zhì)量的影響，從而降低背景值[15]?；瘖y品歐洲遺傳毒性專項(xiàng)組（CosmeticsEurope Genotoxicity Task Force） 和德國聯(lián)邦教育與研究部使用全皮模型如EpiDerm FT 或Phenion? FT研究使用其開展彗星試驗(yàn)的重復(fù)性和預(yù)測(cè)效力[16]。在Reisinger 等[16] 進(jìn)行的驗(yàn)證研究中，使用絲裂霉素C、氯化鎘、N- 乙基-N- 硝基脲、7，12- 二甲基苯并蒽、沒食子酸丙酯、丁香酚、鄰苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯、環(huán)己酮等8 種化學(xué)品在Phenion? 全層皮膚模型上進(jìn)行驗(yàn)證，3D 皮膚彗星測(cè)定法顯示出較高的預(yù)測(cè)能力以及良好的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間可重復(fù)性。

Flamand et al，使用EpiSkinTM 研究洛美沙星的光遺傳毒性，即模型涂抹洛美沙星并經(jīng)紫外照射后再取皮膚組織開展彗星試驗(yàn)，驗(yàn)證只有洛美沙星涂抹與紫外照射同時(shí)存在時(shí)組織細(xì)胞的尾DNA 百分率顯著性升高，提示其存在光遺傳毒性。該結(jié)果與人體皮膚試驗(yàn)結(jié)果一致[17]，提示模型具有較好的代謝功能。我國研發(fā)的人源重建皮膚模型EpiKutis 也已使用鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8- 甲氧基補(bǔ)骨脂和十二烷基硫酸鈉建立了國產(chǎn)人源重建皮膚模型的體外光毒性試驗(yàn)方法[18]，為皮膚光毒性替代檢測(cè)方法提供了新補(bǔ)充。

化妝品遺傳毒性評(píng)價(jià)的決策思路

COLIPA 基于上述研究結(jié)果，提出以下化妝品遺傳毒性評(píng)價(jià)的決策思路[6]。首先應(yīng)根據(jù)已有的數(shù)據(jù)和資料，包括理化屬性、暴露和代謝方式、遺傳毒性及致癌性數(shù)據(jù)對(duì)化妝品原料的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)判。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行證據(jù)權(quán)重分析（weight of evidence，WoE），判斷是否有足夠數(shù)據(jù)支持化合物具有或不具有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。如果當(dāng)前數(shù)據(jù)足夠作出判斷，則進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析，認(rèn)為化合物具有遺傳毒性或人體暴露后的致癌性風(fēng)險(xiǎn)極低，無需后續(xù)試驗(yàn)。如果當(dāng)前數(shù)據(jù)不足以作出判斷，則開展Ames 試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)/ 染色體畸變?cè)囼?yàn)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)。體外試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，再次使用證據(jù)權(quán)重法進(jìn)行分析并得到結(jié)論。如體外試驗(yàn)結(jié)果為陽性，需判斷所選擇的試驗(yàn)方法是否適宜及是否充分。

體外試驗(yàn)結(jié)果為陽性的第一種可能即Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陽性，而體外微核試驗(yàn)/ 染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。此時(shí)，需進(jìn)行哺乳動(dòng)物基因突變?cè)囼?yàn)。如hprt 基因突變?cè)囼?yàn)為陰性，再結(jié)合Ames 試驗(yàn)陽性結(jié)果與哺乳動(dòng)物試驗(yàn)體系的不相關(guān)性分析，可排除Ames 試驗(yàn)陽性結(jié)果帶來的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)擔(dān)憂。另一個(gè)方案是開展敘利亞倉鼠胚胎（Syrian hamster embryo，SHE） 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。該方法通過檢測(cè)原代SHE 細(xì)胞形態(tài)變化，評(píng)價(jià)化合物的致癌性風(fēng)險(xiǎn)，試驗(yàn)結(jié)果與嚙齒動(dòng)物致癌性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的一致性達(dá)到近80%[19]。含芳香胺化合物的染發(fā)劑通常在Ames 試驗(yàn)中得到陽性結(jié)果，但SHE 試驗(yàn)可以對(duì)存在致癌性的芳香胺和非致癌性的芳香胺進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分（結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到90%）[20]。它也可以對(duì)遺傳毒性致癌性化合物（直接作用于機(jī)體遺傳物質(zhì)的致癌物） 和非遺傳毒性致癌性化合物（不直接作用于機(jī)體遺傳物質(zhì)的致癌物） 進(jìn)行區(qū)分。值得注意的是，因該方法涉及放射線的使用，其推廣和普及受到了限制。此外，基于3D 皮膚模型的彗星試驗(yàn)也可以作為第三種選擇。彗星試驗(yàn)有助于檢測(cè)到廣譜的DNA 損傷（包括基因突變和染色體損傷）。此外，可考慮Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陽性是否與閾值有關(guān)?；跈C(jī)體的保護(hù)性DNA修復(fù)機(jī)制，人體通?？扇萑痰退紻NA 損傷，如果實(shí)際暴露量低于某一閾值則致癌性風(fēng)險(xiǎn)可忽略。如研究發(fā)現(xiàn)烷化劑甲磺酸乙酯在體外和體內(nèi)均存在作用閾值[21]。進(jìn)行閾值分析時(shí)需結(jié)合暴露水平與閾值濃度進(jìn)行評(píng)估。

體外試驗(yàn)結(jié)果為陽性的第二種可能即Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陰性，而體外微核試驗(yàn)/ 染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陽性。后續(xù)試驗(yàn)的首選方法是開展基于3D 皮膚模型的微核試驗(yàn)或彗星試驗(yàn)，然而該試驗(yàn)尚不能成為一個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，但作為常規(guī)體外微核和彗星試驗(yàn)的后續(xù)試驗(yàn)有助于證據(jù)權(quán)重評(píng)估[6]。此外，SHE 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和閾值分析也可作為備選后續(xù)評(píng)估方法。

體外試驗(yàn)結(jié)果為陽性的第三種可能即Ames 試驗(yàn)結(jié)果和體外微核試驗(yàn)/ 染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果均為陽性。則需要根據(jù)前兩種可能的后續(xù)試驗(yàn)選擇考慮開展適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[6]。

小結(jié)與展望

化妝品原料的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)根據(jù)其本身的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能類似物的信息、代謝物等的現(xiàn)有數(shù)據(jù)或預(yù)測(cè)結(jié)果，以證據(jù)權(quán)重的方式做出評(píng)估。基于3D 皮膚模型的微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)為骨髓和外周血暴露量較低的化合物的遺傳毒性評(píng)價(jià)，提供了有價(jià)值的評(píng)價(jià)方法。對(duì)于局部涂抹類藥物而言，如在標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)組合中體外微核/ 染色體畸變?cè)囼?yàn)中獲得陽性結(jié)果，可考慮以3D 皮膚微核/ 彗星試驗(yàn)作為后續(xù)試驗(yàn)選擇。應(yīng)用3D 皮膚模型開展體外微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)與2D 培養(yǎng)條件下獲得的結(jié)果相比，假陽性率更低，準(zhǔn)確性更高。而基于3D 皮膚模型的彗星試驗(yàn)作為微核試驗(yàn)的重要補(bǔ)充，后續(xù)需對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。在體外替代評(píng)價(jià)方法大行其道的趨勢(shì)下，如何優(yōu)化體外遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)條件及策略、驗(yàn)證3D 模型的代謝能力和確證該模型的可靠性，成為現(xiàn)階段需著力攻克的重點(diǎn)。