白術葉片DNA提取方法的優(yōu)化

蔣小剛　王華　周武先　由金文　張美德

摘要［目的］優(yōu)化白術葉片DNA提取方法，提取高質量DNA，用于分子生物學研究。［方法］以白術葉片為材料，比較常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA的效果，并對改良CTAB法中的裂解溫度、裂解時間、核分離液解離次數(shù)進行優(yōu)化，用瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸測定儀檢測DNA的濃度和純度。最后通過ISSR-PCR驗證優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果。［結果］4種方法中，改良CTAB法提取白術葉片DNA效果最好。針對葉片的改良CTAB法的優(yōu)化條件為裂解溫度65 ℃、裂解時間20 min、解離次數(shù)2 次；ISSR-PCR驗證結果表明擴增條帶清晰穩(wěn)定，無拖尾。［結論］優(yōu)化后的改良CTAB法提取白術葉片DNA質量高，可用于白術種質資源遺傳多樣性分析。

關鍵詞白術；DNA；提取方法；改良CTAB法

中圖分類號R284文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）11-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala Leaves

JIANG Xiao-gang，WANG Hua，ZHOU Wu-xian et al（Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000）

Abstract［Objective］To optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.［Method］A.macrocephala leaves were used as material，the DNA extraction effects of four methods （conventional CTAB，modified CTAB，SDS and Kit method） were compared，and the cracking temperature，cracking time and times of nuclear separation liquid extraction in the modified CTAB method were optimized，the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis and spectrophotometer.Finally，the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.［Result］Among the four extraction methods，the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows：cracking temperature was 65 ℃，cracking time was twenty minutes，dissociation times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable，without any trailing.［Conclusion］The optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.

Key wordsAtractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method

白術 （Atractylodes macrocephala Koidz.） 屬于菊科蒼術屬多年生草本植物，以根莖入藥，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎的功效［1］?；诜肿由飳W技術開展藥用植物種質資源評價工作尤為重要，而高效提取DNA是更好進行分子生物學研究的前提，此外，大多數(shù)藥用植物組織中富含多糖、多酚等物質，常規(guī)方法提取的DNA較難滿足PCR、基因克隆、測序等分子生物學需求，因此很多學者開展了藥用植物基因組DNA提取方法的優(yōu)化研究，以建立高效提取高質量DNA的方法。

邵亞林等［2］以杏黃兜蘭葉片為材料，比較了CTAB法、改良CTAB法、高鹽低pH法和 SDS法提取DNA的效果，結果表明，改良CTAB法優(yōu)于其他方法，但提取的DNA存在一定蛋白質污染，且未進行PCR擴增反應驗證。鄭斯斯等［3］以殼斗科植物葉片為材料，比較不同方法提取DNA效果并對最佳方法進行優(yōu)化，結果表明，優(yōu)化后的改良CTAB法提取DNA濃度和純度高，適用于PCR擴增和酶切反應。針對不同藥用植物或藥用植物的不同組織，需建立相適應的DNA提取方法，而有關白術不同組織基因組DNA提取方法的研究較少，多采用CTAB法。如黃恒等［4］對改良CTAB法和SDS法提取白術葉片基因組DNA的效果進行比較，結果表明，改良CTAB法提取白術葉片DNA質量高于SDS法，可作為模板用于分子標記研究，但提取DNA用時較長；王志安等［5］采用CTAB法提取白術幼嫩葉片的基因組DNA，并構建了DNA指紋圖譜，結果表明，提取的白術基因組DNA適用于AFLP指紋圖譜分析，但存在一定量蛋白質、多酚等物質污染；曹亮等［6］采用改良CTAB法提取白術、蒼術的干種子DNA，并通過多重PCR技術對白術、蒼術混雜種子進行鑒別，結果表明，提取的DNA模板滿足于多重PCR反應，但提取DNA所需時間較長。也有研究采用試劑盒法提取白術DNA，如余亞東等［7］采用試劑盒法提取白術、蒼術根莖DNA，并建立了鑒別白術、蒼術等的DNA條形碼技術，結果表明，提取的DNA模板適用于PCR擴增及進一步的種質鑒定研究，但DNA提取量較低，且成本高。以上研究，以白術為研究對象，主要采用改良CTAB法提取基因組DNA，基本能滿足分子生物學的研究，但存在用時較長、DNA質量偏低的問題，雖然試劑盒法能有效去除DNA中的多糖多酚物質，但成本較高、提取DNA量較少，同時伴隨一定降解［3］。該研究以白術幼嫩葉片為材料，比較常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA的效果，并對改良CTAB法中的裂解溫度、裂解時間、解離次數(shù)等因素進行優(yōu)化，然后用瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸檢測儀檢測DNA濃度和純度，最后通過ISSR-PCR驗證優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果，以便用于白術遺傳多樣性分析、種質鑒定等研究。

1材料與方法

1.1試驗材料供試材料包括一年生白術幼嫩葉片。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）、核糖核酸A（RNaseA）、氯仿、異戊醇、異丙醇、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖，均購自武漢中恩科技有限公司。主要儀器設備包括離心機（SIGMA 3K15）、電泳儀（DYCP-31DN）、超微量核酸蛋白測定儀（Thermo NANODROP ONE）、PCR儀（DYY-12）。

1.2試驗方法

1.2.1不同DNA提取方法。采用常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法和試劑盒法提取白術葉片基因組DNA。

1.2.1.1常規(guī)CTAB法。參照馬輝等［8］的方法并進行改進，具體步驟如下：取0.2 g白術幼嫩葉片于預冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉入2 mL離心管中，加入800 μL CTAB核裂解液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA，pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2％CTAB;2％PVP;2％β-巰基乙醇）和20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，65 ℃水浴40 min（期間每隔10 min輕輕搖動離心管一次），然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），混勻30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液至2 mL離心管中，然后加入等體積的預冷異丙醇，混勻，12 000 r/min離心15 min，棄上清。用95％乙醇清洗沉淀2次，室溫風干，加50 μL TE緩沖液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混勻，室溫放置30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2改良CTAB法。取0.2 g白術幼嫩葉片于預冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉入2 mL離心管中，加入1.5 mL 4 ℃預冷的核分離液混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清收集沉淀，將上述收集沉淀按常規(guī)CTAB法提取。

1.2.1.3SDS法。參照王景雪等［9］的方法稍作改動，具體步驟如下：①取0.2 g白術幼嫩葉片于預冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉入2 mL離心管中，加入800 μL溶液I （500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2％PVP;2％β-巰基乙醇），置于室溫數(shù)分鐘至解凍；②加入280 μL 10％SDS，輕輕混勻，45～65 ℃水浴20～40 min（期間每隔10 min輕輕搖動離心管一次）；③取出后立即置于冰上，并加入120 μL 5 mol/L 醋酸鉀于冰上反應30 min，在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min；④取上清液，加入等體積異丙醇，輕輕混勻后，-20 ℃放置1 h，于4 ℃下離心20 min；⑤棄上清液，用500 μL TE緩沖液溶解沉淀，向其中加入2/3體積的氯仿-異戊醇（24∶1）混勻后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；⑥取上清液，向其中加入等體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaCl，于-20 ℃放置1 h，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min；⑦棄上清，用95％乙醇洗滌沉淀1次，室溫風干；⑧加50 μL TE緩沖液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混勻，室溫放置30 min，然后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4試劑盒法。采用天根生化科技（北京）有限公司生產的新型植物基因組提取試劑盒（DP320-02）。具體步驟如下：①取植物新鮮組織100 mg或干重組織20 mg加入液氮充分碾磨；②加入400 μL緩沖液LP1和6 μL RNaseA（10 mg/mL）旋渦振蕩1 min，室溫放置10 min；③加入130 μL緩沖液LP2，充分混勻旋渦振蕩1 min，然后12 000 r/min離心5 min，將上清移至新的離心管中；④加入1.5倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻15 s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；⑤將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中，然后12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），然后12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑦重復操作步驟⑥；⑧12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3室溫放置2 min徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；⑨將吸附柱CB3轉入新的1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.2改良CTAB法提取白術葉片DNA的優(yōu)化試驗。

1.2.2.1裂解溫度優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術葉片DNA，裂解溫度設為45、55、65 ℃，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.2.2裂解時間優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術葉片DNA，裂解時間設為20、30、40 min，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.2.3核分離液解離次數(shù)優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術葉片DNA，解離次數(shù)設為0、1、2次，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.3DNA提取濃度和純度檢測。

1.2.3.1超微量核酸蛋白測定儀檢測。取2 μL DNA提取液，用超微量核酸測定儀檢測DNA濃度（ng/μL）和純度。DNA提取量（mg/g）＝DNA濃度×50×10-6/組織鮮重或干重；DNA質量判定標準：當OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.80時，純DNA；當OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.80～2.00時，屬于正常范圍；當OD₂₆₀/OD₂₈₀＞2.00時，說明有大量RNA污染；當OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.80時，說明有蛋白質、酚類等污染。

1.2.3.2瓊脂糖凝膠電泳檢測。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，并用凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照。

1.2.3.3改良CTAB法優(yōu)化后的效果驗證。采用優(yōu)化的改良CTAB法提取白術葉片基因組DNA，并以此為模板，用中藥材條形碼引物ITS2（F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）和ISSR引物UBC845（5′-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3′）進行擴增。PCR反應體系：20 μL反應體系中，2×Taq Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，引物2 μL，ddH2O 7 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性0.50 min，56 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.0 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2結果與分析

2.1不同方法提取白術葉片DNA的效果比較用常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法和試劑盒法提取白術葉片基因組DNA，結果如表1所示。4種方法中，改良CTAB法的DNA提取量最高，為0.015 1 mg/g；試劑盒法的DNA提取量僅次于改良CTAB法；SDS法提取量最低，僅為0.005 0 mg/g。除試劑盒法外的其他3種方法葉片DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范圍（1.80～2.00）。綜上所述，改良CTAB法為提取白術葉片DNA的最優(yōu)方法。

2.2裂解溫度對改良CTAB法提取白術葉片DNA效果的影響由表2可知，裂解溫度在45～55 ℃，隨著裂解溫度升高，改良CTAB法的白術葉片DNA提取量呈現(xiàn)升高的趨勢。裂解溫度為65 ℃時， DNA提取量最高，達到了0.027 7 mg/g。不同裂解溫度下，白術葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.92～1.96，表明不同裂解溫度對改良CTAB法DNA提取純度無明顯影響。綜上可知，改良CTAB法提取白術葉片DNA的最適裂解溫度為65 ℃。

2.3裂解時間對改良CTAB法提取白術葉片DNA效果的影響由表3可知，裂解時間在20～40 min，隨著裂解時間增加，白術葉片DNA提取量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，裂解時間為20 min時，葉片DNA提取量最高（0.024 0 mg/g）。裂解時間為20、30 min時，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.95～1.97，DNA較為干凈，無明顯蛋白質、RNA污染，而裂解時間為40 min時，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀僅為1.63，DNA含有少量雜質，存在一定蛋白質、酚類物質污染。綜上所述，改良CTAB法提取白術葉片DNA的最佳裂解時間為20 min。

2.4核分離液解離次數(shù)對改良CTAB法提取白術葉片DNA效果的影響由表4可知，隨著核分離液解離次數(shù)增加，葉片DNA提取量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，即葉片DNA提取量最大時的解離次數(shù)為2次。不同解離次數(shù)下，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范圍（1.80～2.00）。綜上所述，改良CTAB法提取白術葉片DNA的最佳解離次數(shù)為2次。

2.5優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果驗證用優(yōu)化的改良CTAB法提取白術葉片基因組DNA，以此為模板，用中藥材條形碼引物ITS2和引物UBC845進行擴增，驗證提取DNA的效果，結果如圖1所示，擴增條帶清晰穩(wěn)定、無雜帶，優(yōu)化的改良CTAB法提取的白術葉片基因組DNA可用于后續(xù)白術遺傳多樣性分析、種質鑒定等研究。

3討論與結論

目前的研究多采用改良CTAB法的試劑盒法提取白術葉片、根莖、種子的基因組DNA［5-7］，且僅有黃恒等［4］以白術葉片為材料比較了改良CTAB法、SDS法提取DNA效果。該研究以白術葉片為材料，比較了常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA效果，發(fā)現(xiàn)相比常規(guī)CTAB法、SDS法，改良CTAB法提取葉片DNA質量較高，與黃恒等［4］研究認為改良CTAB法提取白術葉片效果優(yōu)于SDS法的結論一致。該研究中，改良CTAB法的DNA提取量略高于試劑盒法，且試劑盒法提取DNA成本較高。綜合來看，改良CTAB法為提取白術葉片DNA的最佳方法。目前，改良CTAB法已廣泛應用于提取油菜等作物［10-13］的基因組DNA，提取效果較好。

針對特定的分子水平的研究，往往需要提取植物特定組織的DNA，而不同組織或細胞結構、成分的差異導致同一方法提取不同組織DNA效果差異較大，因此需要優(yōu)化適應于植物不同組織的DNA提取方法［14］。水浴裂解時間對于DNA提取效果非常重要，裂解時間過短，DNA不能釋放完全，導致提取率較低，而裂解時間過長，DNA會發(fā)生降解［15］。該研究通過分析改良CTAB法中裂解時間對白術葉片DNA提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)裂解時間為20 min時，葉片DNA的提取量最高，低于以白術葉片、種子為材料的研究采用的裂解時間［5，7，9］，表明該研究對白術改良CTAB法的裂解時間的優(yōu)化效果較好。

細胞質中多酚類等次生代謝物質會影響DNA提取量，PVP 能有效去除DNA中的多酚物質；β-巰基乙醇能有效防止酚氧化成醌類物質，避免褐變，使酚易被去除；因此通過在核分離液中加入PVP和β-巰基乙醇，經過核分離液除去多酚類物質，可有效提高DNA的提取量［8，16-17］。該研究通過分析改良CTAB法中核分離液解離次數(shù)對白術葉片DNA提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)白術葉片解離2 次，DNA提取量最高。

優(yōu)化后的改良CTAB法提取白術葉片DNA效果好，可用于白術遺傳多樣性分析、種質資源鑒定、分子輔助育種等。但該研究僅對改良CTAB法提取白術葉片DNA的主要影響因素進行優(yōu)化，針對特定分子試驗需求，還需做進一步改進，以更好開展后續(xù)白術分子生物學研究，為白術遺傳多樣性分析、種質鑒定等奠定基礎。

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