蚓激酶在缺血再灌注模型中的作用及機(jī)制研究

徐雷 王寶祥

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一種急性腦血管疾病，腦血管阻塞可導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧繼而引發(fā)AIS。AIS 的病死率和致殘率均較高，給患者家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1]。蚓激酶是從傳統(tǒng)中藥地龍?zhí)崛〉囊环N具有生物活性的蛋白水解酶，分子量為25～32 kDa[2]，其包括纖溶酶原激活劑和纖溶酶，有激活抗凝、改善微循環(huán)的作用[3-4]。蚓激酶已在臨床廣泛應(yīng)用于腦卒中和心血管疾病治療[5]。在我國(guó)蚓激酶主要用于治療AIS 或預(yù)防繼發(fā)性缺血性腦卒中[6]。本研究探索蚓激酶在大鼠腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）中的作用及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40 只SPF 級(jí)健康雄性成年大鼠，體重250～300 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組15 只、模型組15 只和對(duì)照組10 只。本研究經(jīng)武警海警總隊(duì)醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：20211104）。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：蚓激酶購(gòu)自北京百奧藥業(yè)股份有限公司（500 萬(wàn)U/支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H110211129），2，3，5-三苯基四唑氯化物（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）購(gòu)自Sigma 公司，IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 及β 肌動(dòng)蛋白（beta-actin，β-actin）引物購(gòu)自上海生工生物公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA 試劑盒（F15810、F15870、F16960、15900）購(gòu)自上海西唐生物有限公司。（3）實(shí)驗(yàn)儀器：腦立體定位儀購(gòu)自廣東省深圳瑞沃德生命科技有限公司（型號(hào)：標(biāo)準(zhǔn)型腦立體定位儀），大鼠腦切片模具購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司（型號(hào)：5 punches），顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司（型號(hào)：IXplore Standard）；激光多普勒血流儀購(gòu)自瑞典Perimed 公司（型號(hào)：PeriFlux 6000）。

1.2 方法

1.2.1 MACO 模型建模 觀察組和模型組大鼠采用線栓法構(gòu)建腦缺血/再灌注模型，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上，切開(kāi)并分離頸部皮膚、肌肉、軟組織，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）。結(jié)扎CCA 近心端及ECA，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA；在CCA 遠(yuǎn)心端放置一打好結(jié)的備用絲線，在此線下端剪一小口，把MACO 拴線由此插入至ICA，當(dāng)達(dá)到18～20 mm時(shí)結(jié)扎ICA。2 h后取出拴線，實(shí)現(xiàn)再灌注，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端并縫合皮膚。神經(jīng)功能評(píng)分≥1分以上為建模成功。建模過(guò)程中觀察組死亡4 只，模型組死亡2只。對(duì)照組僅分離左側(cè)CCA、ECA 和ICA。造模24 h后開(kāi)始給藥，將500 萬(wàn)U/支的蚓激酶溶于25 ml0.9%氯化鈉注射液中，觀察組每只大鼠給予6 ml/d 蚓激酶溶液（約120 U 蚓激酶）灌胃給藥，模型組和對(duì)照組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液6 ml/d，連續(xù)給藥14 d。給藥過(guò)程中，觀察組死亡1 只，模型組死亡3 只。給藥結(jié)束后處死3 組大鼠，留取腦組織。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積測(cè)定 大鼠處死前，使用改良的Longa 五級(jí)4 分法對(duì)3 組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[7]。0 分：無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1 分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2 分：行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：行走時(shí)向右側(cè)傾倒；4 分：無(wú)法行動(dòng)。使用TTC 染色法測(cè)定3 組大鼠腦梗死體積，具體方法為：3 組大鼠麻醉處死后斷頭解剖取腦組織，放入-20 ℃冰箱10 min 左右取出切片，以前囟為基點(diǎn)連續(xù)冠狀面切2 mm 切片。加入2%TTC 溶液37 ℃避光染色30 min，然后在10%甲醛溶液中4 ℃固定2 h。染色后，正常腦組織呈紅色，梗死灶為白色。顯微鏡下拍照，使用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件分析處理，計(jì)算腦梗死體積百分比。計(jì)算公式為：腦梗死體積=∑（每個(gè)切片的白色面積×切片厚度），腦體積=∑（每個(gè)切片的面積×切片厚度），其中∑表示求和。腦梗死體積百分比=（腦梗死體積/腦體積）×100%。

1.2.3 腦組織內(nèi)炎癥因子mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 使用RT-PCR 檢測(cè)3 組大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-10 的mRNA 表達(dá)水平。取新鮮腦組織研磨后，將一部分溶解于1 ml trizol 中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取出腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。IL-1β 上游引物為：5'-ATAGCAGCTTTCGACACTTTGAG-3'，下游引物為：5'-GTCAACTATGCCCGACCATT-3'；IL-6 上游引物為：5'-TTCCC-TACTTCACAAGTC-3'，下游引物為：5'-CTAGGTTTGCCGAGTAG-3'；TNF-α 上游引物為：5'-AGAACTCCAGGCGGTGTCTGTG-3'，下游引物為：5'-GTGGCAAATCGGCTGACGGTGT-3'；IL-10 上游引物為：5'-GACCAGCAAAGGCCATTCCATC- 3'，下游引物為：5'-CATTCTTCACCTGCTCCACTGC-3'；β-actin 上游引物為：5'-AATGAGCTTCGCGTTGCCCC-3'，下游引物為：5'-GCCCTACCTTAGACGACCGT-3'。RT-PCR 為10 μl反應(yīng)體系：5 μl SYBR Green Mix，1 μl 稀釋的cDNA ，0.5 μl 正向，0.5 μl 反向引物（10 μmol/L），3 μl 去離子水。 RT-PCR 循環(huán)條件如下：95 ℃初始變性30 s，然后95 ℃30 s、58 ℃30 s 和72 ℃30 s 的40 個(gè)循環(huán)。βactin 管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化RT-PCR 結(jié)果。得到Ct 值后，計(jì)算目標(biāo)基因與內(nèi)部參照基因的Ct 值之差（ΔCt），計(jì)算每個(gè)樣品的ΔCt 值，使用2-ΔΔCt的公式計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)值，其中ΔΔCt=ΔCt（觀察組或模型組）-ΔCt（對(duì)照組）。

1.2.4 腦組織內(nèi)炎癥因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 使用ELISA 法檢測(cè)3 組大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-10 的蛋白表達(dá)水平。取新鮮腦組織100 mg，加入0.8 ml 預(yù)冷的緩沖液A[10.0 mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid，HEPES）pH=7.9, 10.0 mmol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），1.0 mmol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）]，0.5 mmol/L PMSF 于研缽內(nèi)研磨至勻漿狀，冰浴中裂解30 min，加入50 μl 10%乙基苯基聚乙二醇（nonidet P-40，NP-40）震蕩30 s，4 ℃10 000 r/min 離心20 min，收集上清液，用于檢測(cè)炎癥因子。將稀釋為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本100 μl 加入反應(yīng)孔中，分別加50 μl 生物素標(biāo)記的特異性抗體，封板，37 ℃下500 r/min 孵育1 h；加入洗滌液洗滌4 次后，加入100 μl 親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，封板，37 ℃下500 r/min 孵育30 min，再次洗板4次后，加入100 μl 顯色液，15 min 后加入終止液。于10 min 內(nèi)在酶聯(lián)儀450 mm 波長(zhǎng)下迅速讀板，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積百分比比較 3 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組和模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分高于對(duì)照組，觀察組神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組、模型組大鼠腦梗死體積百分比大于對(duì)照組，觀察組腦梗死體積百分比小于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。腦組織經(jīng)TTC 染色后，非梗死區(qū)域?yàn)榧t色，梗死區(qū)域呈白色。見(jiàn)圖1（封三）。

表1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積百分比比較

圖1 3 組大鼠腦梗死切片

2.2 3 組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子mRNA 表達(dá)水平比較 3 組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10 的mRNA 表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組和模型組IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組，觀察組上述指標(biāo)表達(dá)水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。模型組IL-10 的mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組，觀察組IL-10 的mRNA 表達(dá)水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較

2.3 3 組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較 3 組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10 的蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。觀察組和模型組IL-1β、IL-6 和TNF-α的蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，觀察組上述指標(biāo)表達(dá)水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。模型組IL-10 的蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，觀察組IL-10 的蛋白表達(dá)水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較（pg/ml）

3 討論

AIS 是一種常見(jiàn)的腦血管疾病，起病迅速，致殘率和病死率高，是由各種原因引起的腦組織區(qū)域供血局部障礙，繼而導(dǎo)致腦組織缺血缺氧引起的神經(jīng)功能缺損。本研究分析了與AIS 近期和遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)的因素。蚓激酶是從中藥地龍?bào)w內(nèi)提取的一組絲氨酸蛋白酶，具有激活抗凝、抗炎、改善微循環(huán)等作用。臨床上用于以預(yù)防和治療血栓事件，例如與心肌梗死和腦血栓有關(guān)的疾病[8]。本研究發(fā)現(xiàn)蚓激酶可以減輕缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)功能損傷，減少腦梗死體積，這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。

有研究發(fā)現(xiàn)地龍有效成分能夠降低人腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平[11]。本研究證明了蚓激酶具有抑制炎癥因子表達(dá)的作用，這可能是改善大鼠腦梗死預(yù)后的機(jī)制。急性腦缺血再灌注過(guò)程中，炎癥因子參與腦損傷過(guò)程。缺血區(qū)神經(jīng)元壞死后釋放大量蛋白水解酶、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等物質(zhì)，會(huì)引發(fā)局部炎癥反應(yīng)；小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄促炎性炎癥因子如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等，導(dǎo)致IL-1β、IL-6 和TNF-α 等表達(dá)升高；這些炎癥因子會(huì)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子、趨化因子表達(dá)，從而使循環(huán)中炎性細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮阻塞微血管，造成再灌流期“無(wú)再流”，進(jìn)一步加重加重腦損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注模型中，大鼠腦組織中的炎癥因子mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)蚓激酶能促進(jìn)IL-10的表達(dá)，既往的研究發(fā)現(xiàn)IL-10 在缺血再灌注模型中具有保護(hù)作用。Liang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)IL-10 可以改善缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦梗死體積；Bilbao 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-10 的轉(zhuǎn)基因大鼠，可以耐受缺血再灌注，在該模型中促炎因子如IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)明顯降低，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善。使用過(guò)表達(dá)IL-10 的間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性腦缺血模型大鼠，可以明顯降低腦梗死體積，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷[16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蚓激酶可以減輕缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)功能損傷，減少腦梗死體積；其可能的機(jī)制是抑制腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達(dá)水平，并促進(jìn)抗炎因子IL-10 的表達(dá)水平。本研究雖闡述了蚓激酶治療腦梗死的相關(guān)機(jī)制，但更詳細(xì)的分子通路仍需進(jìn)一步的研究。