Pifithrin-α改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌纖維化的作用及機(jī)制

鄭高暑 胡杰 董天成 林智威 潘培培 梁詩(shī)琪 杜雷雷 孔淑婷 陳星星 龔永生 范小芳 周浩

心肌纖維化是指由于長(zhǎng)期壓力負(fù)荷增加引起大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）蛋白在心肌間質(zhì)中過度沉積，正常心肌組織被纖維化組織替代的病理性重構(gòu)過程，最終導(dǎo)致進(jìn)行性心力衰竭[1]。研究表明，心肌組織中內(nèi)皮細(xì)胞可通過內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）成為間充質(zhì)細(xì)胞，形成大量的肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)心肌纖維化[2]。EndMT 與多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，包括心肌纖維化、系統(tǒng)性硬化、肺動(dòng)脈高壓、心肌梗死和其他纖維化疾病[3-4]。因此，調(diào)控EndMT 過程是抗心肌纖維化的重要靶點(diǎn)。Pifithrin-α 是一種p53 的特異性抑制劑，近期研究發(fā)現(xiàn)Pifithrin-α 具有抑制腎纖維化和肝纖維化的作用[5-6]。本研究探討Pifithrin-α 改善異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)心肌纖維化的作用及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡雄性SD 大鼠24 只，體重185～219（199.25±10.53）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）購(gòu)自中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：wydw2020-0372）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物培養(yǎng)及分組 24 只大鼠采用信封法隨機(jī)分為觀察組、ISO 組和對(duì)照組，每組8 只。觀察組和ISO 組采用5 mg·kg-1·d-1異丙腎上腺素（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：I5627）連續(xù)皮下注射1 周，觀察組再采用2 mg·kg-1·d-1Pifithrin-α（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：P4359）腹腔注射1 次。對(duì)照組連續(xù)皮下注射與ISO 相同體積的0.9%氯化鈉注射液1 周。3 組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)3 周。實(shí)驗(yàn)過程中3 組大鼠均有死亡發(fā)生，在第4 周末時(shí)觀察組剩下5 只，ISO組剩下4只，對(duì)照組剩下3只。

1.2.2 心臟超聲心動(dòng)圖檢查 在第4 周末時(shí)，3 組大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，采用小動(dòng)物心超儀（美國(guó)Phillips 公司，Sonos 5500 型）檢測(cè)3 組大鼠心功能。通過M 型超聲測(cè)量心率、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall dimension，LVPWd）和射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)分析 心臟超聲心動(dòng)圖檢查后，3 組大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈插入心導(dǎo)管進(jìn)入左心室測(cè)量左心室功能及壓力。記錄左心室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室平均收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室壓力最大上升速率（maximum rate of leftventricular pressure rise，+dp/dtmax）和左心室壓力最大下降速率（maximum rate of left ventricular pressure descent，-dp/dtmax）。

1.2.4 心臟重量指數(shù)測(cè)定 上述檢測(cè)完成后，3 組大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，稱量體重，將預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液注入左心室，直至心臟變白，并用濾紙吸干水分。解剖并分別稱量左、右心室，分別計(jì)算左心室重量指數(shù)（left ventricle weight index，LVWI）及右心室重量指數(shù)（right ventricle weight index，RVWI），計(jì)算方法為心室游離壁重量/體重。

1.2.5 組織病理學(xué)和膠原表達(dá)水平檢測(cè) 采用4%甲醛固定心臟組織，石蠟包埋，切片。4 μm 厚切片，HE 和Masson 染色，使用光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司，TS100型）拍攝圖像，用Image Pro Plus 圖像處理軟件（美國(guó)Media Cybernetics 公司）分析測(cè)量藍(lán)色纖維化面積和總面積。計(jì)算膠原體積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF），CVF=藍(lán)色纖維化面積/總面積×100%。每只大鼠取1 塊100 mg 新鮮心肌組織，加入1 ml 的PBS（pH 7.4）中，勻漿后制作組織懸液，3 000 r/min 離心20 min，回收上清液，采用Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原（武漢云克隆公司，批號(hào)：SEA571Ra，SEA176Ra）ELISA 試劑盒檢測(cè)膠原表達(dá)水平。

1.2.6 心肌組織EndMT 指標(biāo)檢測(cè) 每只大鼠心臟取新鮮心肌組織用放射免疫沉淀裂解緩沖液提取蛋白，采用Western blot 方法檢測(cè)心肌組織蛋白表達(dá)水平。等量的蛋白質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜后用5%脫脂奶粉封閉，然后用一抗在4 ℃下孵育過夜。EndMT表現(xiàn)為內(nèi)皮標(biāo)志物如分化簇31（cluster of differentiation 31，CD31）的表達(dá)水平降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白的表達(dá)水平增加，故采用p53 一抗（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：2524S），CD31 一抗（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab28364），α-SMA 一抗（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：A5228），波形蛋白一抗（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：10366-1-AP）孵育過夜，次日用二抗在室溫下孵育1 h，用凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司Hercules 型）掃描蛋白條帶，分析蛋白表達(dá)水平。采用免疫熒光染色對(duì)心肌組織染色，將心肌組織與CD31 一抗和α-SMA一抗置于4 ℃5%牛血清白蛋白中孵育過夜，染色次日在37 ℃下加入二抗孵育1 h。用PBS 洗滌數(shù)次，再用10 mg/ml 的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）孵育5 min 以上進(jìn)行細(xì)胞核染色。采用倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，TS100 型）拍攝圖像，觀察蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 細(xì)胞EndMT 指標(biāo)檢測(cè) 將HMVECs 放在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90% 以上時(shí)傳代。傳代后將細(xì)胞分為觀察組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）組和對(duì)照組3組。觀察組和TGF-β 組細(xì)胞采用20 ng/ml TGF-β（美國(guó)派普泰克公司，批號(hào)：100-21）處理24 h，其中觀察組細(xì)胞再采用100 μmol/L Pifithrin-α 處理48 h，TGF-β 組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h；對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)78 h。3 組細(xì)胞用放射免疫沉淀裂解緩沖液提取蛋白。隨后采用上述Western blot 方法檢測(cè)3 組細(xì)胞p53、CD31、α-SMA 和波形蛋白等表達(dá)水平。采用上述免疫熒光染色的方法對(duì)3組細(xì)胞染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較 3組大鼠LVEDd、LVPWd 和EF 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），3組大鼠心率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ISO組大鼠LVEDd 高于對(duì)照組，LVPWd 和EF 低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組大鼠LVEDd 低于ISO 組，LVPWd 高于ISO 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠心功能指標(biāo)的比較

2.2 3 組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 3 組大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ISO 組大鼠LVEDP 高于對(duì)照組，LVSP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組大鼠LVEDP 低于ISO組，LVSP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 高于ISO 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

2.3 3 組大鼠心臟重量指數(shù)的比較 3 組大鼠LVWI和RVWI 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），3 組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ISO 組大鼠LVWI 和RVWI 高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組大鼠LVWI 和RVWI 低于ISO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠心臟重量指數(shù)的比較

2.4 3 組大鼠病理形態(tài)學(xué)及膠原表達(dá)水平比較 ISO組大鼠膠原纖維增生、心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而觀察組和對(duì)照組大鼠心肌纖維化較輕。3組大鼠CVF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ISO 組大鼠CVF 高于對(duì)照組，觀察組大鼠CVF 低于ISO 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ISO 組大鼠Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平高于對(duì)照組，觀察組大鼠Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平低于ISO 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1（插頁(yè)）。

圖1 3 組大鼠大鼠病理形態(tài)鏡下所見及膠原表達(dá)水平比較（A：3 組大鼠HE 染色檢測(cè)心肌纖維化程度，×40；3 組大鼠HE 染色檢測(cè)心肌纖維化程度，×200；C：3 組大鼠Masson 染色檢測(cè)心肌纖維化程度，×40；D：3 組大鼠Masson 染色檢測(cè)心肌纖維化程度，×200；E：3 組大鼠心肌組織CVF 比較；F：3 組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平比較）

2.5 3 組大鼠心肌組織EndMT 指標(biāo)比較 3 組大鼠心肌組織CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ISO 組大鼠心肌組織α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平高于對(duì)照組，CD31 表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組大鼠心肌組織α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平低于ISO 組，CD31 表達(dá)水平高于ISO 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。免疫熒光染色檢測(cè)ISO 組大鼠心肌組織α-SMA 表達(dá)水平較高，CD31 表達(dá)水平較低；觀察組和對(duì)照組大鼠心肌組織α-SMA 表達(dá)水平較低，CD31 表達(dá)水平較高。見圖2（插頁(yè)）。

2.6 3 組細(xì)胞EndMT 指標(biāo)的比較 3 組細(xì)胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。TGF-β 組細(xì)胞α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平高于對(duì)照組，CD31 表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。觀察組細(xì)胞α-SMA、波形蛋白和p53 表達(dá)水平低于TGF-β 組，CD31 表達(dá)水平高于TGF-β 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。免疫熒光染色檢測(cè)TGF-β 組細(xì)胞α-SMA 表達(dá)水平較高，CD31 表達(dá)水平較低；觀察組和對(duì)照組細(xì)胞α-SMA 表達(dá)水平較低，CD31 表達(dá)水平較高。見圖3（插頁(yè)）。

圖3 3 組細(xì)胞EndMT 指標(biāo)比較（A：3 組細(xì)胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 蛋白表達(dá)電泳圖；B：3 組細(xì)胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 蛋白表達(dá)水平比較；C：3 組細(xì)胞CD31 和α-SMA 表達(dá)水平）

3 討論

心肌纖維化是各類心臟疾病的重要病理特征。研究證實(shí)，在終末期心力衰竭的患者心肌組織中，存在ECM 的大量堆積，表現(xiàn)為心肌纖維化。大量ECM堆積在心肌間質(zhì)中，可惡化心功能和誘導(dǎo)心律失常的發(fā)生，最終發(fā)展為終末期心力衰竭[7]。因此，尋找有效的心肌纖維化治療靶點(diǎn)，對(duì)延緩心力衰竭、降低病死率有重要臨床意義。皮下注射ISO 是制備心肌纖維化動(dòng)物模型的經(jīng)典方法[8]。ISO 通過結(jié)合于β1-腎上腺素受體來加強(qiáng)心肌收縮力，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，誘導(dǎo)EndMT 和成纖維細(xì)胞激活，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[9]。

心肌纖維化過程包括成纖維細(xì)胞的增殖及其向肌成纖維細(xì)胞分化，而表達(dá)α-SMA 的肌成纖維細(xì)胞是分泌細(xì)胞間質(zhì)ECM 蛋白的主要細(xì)胞[10-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，心肌成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加可來源于多種細(xì)胞，如心肌原位成纖維細(xì)胞的增殖、循環(huán)中的巨噬細(xì)胞以及發(fā)生EndMT 的內(nèi)皮細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞來源的成纖維細(xì)胞約占32%[12-13]。EndMT 是內(nèi)皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征而失去內(nèi)皮細(xì)胞特征的過程。在EndMT 過程中，內(nèi)皮標(biāo)志物如CD31 和鈣黏蛋白的表達(dá)水平降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物如α-SMA、成纖維細(xì)胞特異蛋白-1 和波形蛋白的表達(dá)水平增加[14]。發(fā)生EndMT 的內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)蛋白骨架重排、細(xì)胞間黏附減少和偽足出現(xiàn)，并且細(xì)胞的遷移侵襲和增殖的能力增強(qiáng)[15]。研究證實(shí)，EndMT 促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展，而抑制EndMT 可減輕心肌纖維化，改善心功能[16]。本研究結(jié)果提示Pifithrin-α 抑制了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌EndMT。

本研究通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p53 在ISO 誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化模型和TGF-β 誘導(dǎo)的細(xì)胞EndMT過程中表達(dá)水平升高。p53 是最廣為人知的腫瘤抑制基因，除了作為細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期阻滯和凋亡的主要調(diào)節(jié)因子外[17-18]，p53 還參與控制多種生物學(xué)過程的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如分化、遷移或血管生成[19-20]，在纖維化疾病中亦發(fā)揮重要影響[21]。p53 在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但當(dāng)細(xì)胞受到低氧等應(yīng)激后，p53 表達(dá)水平上調(diào)并被激活[22]。p53 可通過促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)肝臟纖維化，而條件性敲除小鼠肝細(xì)胞p53 基因可減輕肝纖維化[23]。在輸尿管梗阻小鼠模型中，p53 可通過誘導(dǎo)EndMT 促進(jìn)腎纖維化[24]。p53 可與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3（signal transduction molecule3，Smad3）相互作用，通過激活TGF-β1/Smad 信號(hào)通路啟動(dòng)EndMT，導(dǎo)致糖尿病心肌纖維化[25]。研究證實(shí)，p53在心力衰竭患者的心肌活檢組織中表達(dá)水平升高，并且隨著心力衰竭的惡化，p53 表達(dá)水平逐漸升高[26]。小鼠敲除p53 基因可減輕心肌損傷，而激活p53 可惡化左心室功能[27]。Pifithrin-α 是p53 抑制劑，可阻斷其轉(zhuǎn)錄活性。本研究動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均提示，p53 可能是心肌纖維化的重要干預(yù)靶點(diǎn)；Pifithrin-α 可能通過抑制p53 介導(dǎo)的EndMT，減輕大鼠心肌纖維化。

綜上所述，ISO 誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠模型p53 介導(dǎo)的EndMT 水平升高；Pifithrin-α 通過抑制p53 介導(dǎo)的EndMT，減輕心肌纖維化程度，靶向p53 介導(dǎo)的EndMT是心肌纖維化的潛在治療方案。

志謝感謝溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院創(chuàng)新平臺(tái)的幫助