IL-10調(diào)控HaCaT細胞增殖及分化的分子機制

尹雪莉,賈 波,劉 莉,李明聰,張 軍,楊 振,白紅枚,胡偉康,張素梅,張勝權(quán)

人白細胞介素(interleukin, IL)-10屬于II類IL-10家族細胞因子,細胞因子家族包括IL-19、IL-20、IL-28A、IL-28B以及 IL-29等。IL-10由Th2細胞分泌,抑制Th1細胞分泌細胞因子[1]。其基因定位于1號染色體(1q32.1),編碼17～20 ku糖蛋白[1-2]。IL-10受體由α、β兩個亞單位組成,廣泛表達于多種組織、細胞,包括皮膚角質(zhì)形成細胞[3]。IL-10通過與其受體激活JAK-STAT、PI3K、MAPK等信號途徑調(diào)節(jié)免疫功能,主要表現(xiàn)為抑制IL-1α、 IL-1β、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-18、 IL-23、TNF-α等炎癥因子表達[4]。研究[5]表明IL-10與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),包括銀屑病。銀屑病是炎癥性皮膚疾病,以皮膚角質(zhì)形成細胞過度增殖及分化不全為特征,目前認為其發(fā)病機制是細胞免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病;免疫細胞及皮膚角質(zhì)形成細胞分泌的促炎癥因子,包括TNF-α、IL-17和IL-22,促進皮膚角質(zhì)形成細胞過度增殖及抑制分化。而IL-10能抑制這些促炎因子的分泌,理論上是潛在的銀屑病治療的靶點[5]。在銀屑病皮損中,IFN-γ和TNF-α呈現(xiàn)高表達,而Th2細胞分泌IL-4和IL-10因子相對表達不足[6];此外,研究[7-8]顯示,IL-10啟動子區(qū)域的多態(tài)性與銀屑病的發(fā)病相關(guān),但IL-10在皮膚組織中的作用仍不十分清楚。該研究主要探討IL-10對皮膚角質(zhì)形成細胞的增殖及分化等影響,初步揭示IL-10在銀屑病發(fā)病中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco 公司);0.25%胰酶、青-鏈霉素溶液、細胞周期試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司); IL-10 (美國Peprotech 公司);AKT、磷酸化 AKT (pAKT)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1 /2 (pERK1/2)(美國 Sant Cruz 公司); PD98059 、LY294002(美國 Sigma公司); TRIzol、SYBR Green 染料、RT-qPCR 擴增試劑盒(日本 TaKaRa 公司); Real-time 引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);MTS試劑盒(美國Promega公司);HaCaT 永生化角質(zhì)細胞為本實驗室保存。

1.2 引物從數(shù)據(jù)庫National Center for Biotechnology Information (nih.gov) 檢索獲得相關(guān)基因序列,Premier 7.0 設(shè)計引物,引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 將對數(shù)期HaCaT 細胞0.25%胰酶消化接種于6孔板中,用含 5% 胎牛血清,1% 雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基,在 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2MTS檢測細胞增殖 將對數(shù)期HaCaT 細胞0.25%胰酶消化計數(shù)每孔接種5 000個細胞于96孔板中,以0、3、10、30 ng/ml濃度的IL-10處理HaCaT細胞,分別在時間點(0、24、48、72 h)每孔加入20 μl MTS,孵育30 min后,置于酶標儀中檢測450 nm處吸光度值。

1.3.3流式細胞儀分析細胞周期 將對數(shù)期HaCaT 細胞用0.25%胰酶消化接種于6孔板中, 10 ng/ml的IL-10處理HaCaT細胞24、48 h,依據(jù)細胞周期試劑盒說明書,分別收集細胞;細胞固定:加入1 ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4 ℃固定30 min預(yù)冷PBS洗2次;每管細胞加入500 μl碘化丙啶(PI)染色,常溫避光30 min,流式細胞儀上機檢測。

1.3.4RT-qPCR檢測K1、K5、Involucrin mRNA水平表達 HaCaT細胞接種12孔板,次日換液;特異性抑制劑(PD98059 70 μmol/L LY294002,32 μmol/L)培養(yǎng)1 h, 然后加入IL-10 (10 ng/ml) 培養(yǎng)1 h,加入1.2 mmol/L CaCl2繼續(xù)培養(yǎng)12 h,TRIzol 提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,以此為模板,按照 TaKaRa 公司的說明書配好反應(yīng)體系。預(yù)變性:95 ℃、30 s,循環(huán)1次;PCR反應(yīng):95 ℃、5 s,60 ℃、20 s, 循環(huán)40次。數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計處理。

1.3.5Western blot 分析相關(guān)蛋白水平 用不同濃度的IL-10處理HaCaT細胞, 提取總蛋白,蛋白定量后,加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃,煮沸5 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白; 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜; 一抗pERK1 /2(1 ∶500)和 pAKT(1 ∶500)及Actin(1 ∶1 000), 4 ℃過夜; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育 2 h; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;濾紙吸干,涂ECL 發(fā)光劑,曝光、拍照、Image J 圖像軟件分析各目的蛋白水平變化。

2 結(jié)果

2.1 IL-10對HaCaT細胞增殖的影響為了探討IL-10是否體外影響HaCaT細胞增殖,以圖中所示濃度及時間用IL-10處理HaCaT細胞,結(jié)果顯示在以0、3、10、30 ng/ml的IL-10處理的HaCaT分別與同時間點(0、24、48、72 h)的對照組(0 ng/ml, IL-10)相比其細胞增殖未見顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 MTS分析IL-10對HaCaT細胞增殖調(diào)控結(jié)果(n=6)

2.2 IL-10對HaCaT細胞周期的影響為了進一步驗證IL-10對HaCaT細胞增殖的影響,該實驗以10 ng/ml的IL-10處理HaCaT細24、48 h, PI染色后,流式細胞儀檢測IL-10對HaCaT細胞周期的影響。如圖2所示,IL-10處理HaCaT細胞24和48 h,與對照組(0 ng/ml)相比,10 ng/ml IL-10處理的HaCaT,其細胞各期(G1、S、G2)細胞數(shù)量百分比未見顯著性差異,提示IL-10對HaCaT細胞周期無顯著性影響。

圖2 流式細胞術(shù)分析IL-10對HaCaT細胞周期的調(diào)控(n=3)

2.3 IL-10上調(diào)CaCl2誘導(dǎo)的HaCaT細胞分化標志物INV的表達為了探究IL-10對HaCaT細胞分化的影響,加入IL-10(終濃度10 ng/ml)處理HaCaT 1 h后,加入或不加CaCl2,終濃度為1.2 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,Western blot檢測HaCaT角質(zhì)形成細胞的分化標志物(K1表達于顆粒層;K5表達于基底層;Involucrin表達于棘層),IL-10(10 ng/ml)能夠協(xié)同CaCl2誘導(dǎo)的HaCaT角質(zhì)形成細胞分化標志物Involucrin的表達,如圖3所示,單獨IL-10處理24 h內(nèi)對Involucrin沒有顯著影響,單獨CaCl2處理24 h上調(diào)Involucrin的表達,而IL-10處理48及72 h,IL-10可以誘導(dǎo)Involucrin表達,且與CaCl2有協(xié)同效應(yīng)。IL-10單獨處理HaCaT細胞24 h,上調(diào)K5差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但48、72 h表達水平略有降低,而對K1表現(xiàn)為抑制。

圖3 IL-10上調(diào)經(jīng)CaCl2誘導(dǎo)的HaCaT角質(zhì)形成細胞分化標志物(n=3)

2.4 IL-10通過PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑調(diào)控HaCaT角質(zhì)形成細胞分化的作用為了探討IL-10調(diào)控HaCaT細胞分化標志蛋白分子表達的分子機制,IL-10(10 ng/ml)刺激HaCaT細胞不同時間, Western blot分析IL-10是否激活 PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑,與對照組(相同培養(yǎng)條件未加IL-10), IL-10分別在15和30 min開始顯著增加pAKT及pERK1/2的水平,分別在45和120 min達到峰值,而對總AKT及ERK1/2沒有顯著性影響,提示IL-10能夠激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2。同時特異性抑制劑PD98059(MAPK抑制劑)或LY294002(AKT抑制劑)能夠阻斷IL-10對PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑的激活效應(yīng)。見圖4。

圖4 IL-10誘導(dǎo)AKT及ERK1/2磷酸化(n=3)

2.5 特異性抑制劑預(yù)處理后IL-10對HaCaT角質(zhì)形成細胞分化的影響IL-10能夠激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2信號途徑,為了探討IL-10促進HaCaT細胞分化蛋白表達是否依賴其激活該2條信號途徑,以特異性抑制劑 (PD98059或LY294002) IL-10(10 ng/ml)單獨或聯(lián)合處理HaCaT細胞12 h,RT-qPCR 檢測分化標志物的mRNA水平相對表達,Western blot檢測分化蛋白標志物表達,抑制劑及IL-10同樣處理48 h,分析分化標志物的蛋白水平表達。結(jié)果顯示PD98059能夠顯著抑制IL-10單獨或與CaCl2聯(lián)合誘導(dǎo)的Involucrin及K1 mRNA和蛋白質(zhì)水平表達,PD98059對CaCl2單獨誘導(dǎo)的Involucrin、K1及K5表達沒有顯著影響,PD98059單獨處理也顯著抑制Involucrin、K1及K5 mRNA及蛋白水平表達;LY294002則對各組均顯著抑制(圖5)。

圖5 特異性抑制劑檢測IL-10對HaCaT角質(zhì)形成細胞分化影響(n=3)

3 討論

IL-10是一種多功能細胞因子,調(diào)控多種細胞的生物學(xué)行為,包括免疫及上皮細胞。該研究表明IL-10能上調(diào)HaCaT角質(zhì)形成細分化標志物Involucrin,表現(xiàn)出與鈣離子的協(xié)同效應(yīng),其可能的機制是IL-10部分通過MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信號途徑發(fā)揮其上調(diào)CaCl2誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)細胞分化的作用。

IL-10具有免疫抑制作用的多功能免疫調(diào)節(jié)因子,如抑制樹突細胞炎癥因子的生成及抗原遞呈作用,然而IL-10表現(xiàn)出促進CD8+T細胞的細胞毒活性,因此,IL-10如何發(fā)揮其作用可能與周圍的微環(huán)境相關(guān)[1-2,5],研究[9]表明IL-10受體廣泛表達于多種細胞,包括皮膚角質(zhì)形成細胞。銀屑病主要以皮膚角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化不全為特征[10]。本研究顯示IL-10體外不影響人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞的增殖,但是促進HaCaT細胞分化標志物的表達,提示其抑制銀屑病發(fā)病的機制不僅由于其抑制免疫細胞分泌炎癥細胞因子,可能還直接作用于皮膚角質(zhì)形成細胞發(fā)揮促分化作用。研究[11-12]表明IL-10在銀屑病皮損中低表達,臨床試驗顯示銀屑病皮損局部注射IL-10能夠緩解銀屑病的癥狀。因此,IL-10是否通過促進皮膚角質(zhì)形成細胞分化改善銀屑病癥狀還有待于進一步研究。

該研究表明IL-10能夠激活HaCaT細胞的PI3K-AKT及MAPK信號途徑,并且其促進HaCaT細胞的分化部分依賴MAPK及PI3K-AKT途徑。研究[13-14]表明MAPK-ERK及PI3K-AKT激活能夠促進皮膚角質(zhì)形成細胞的分化,這與IL-10激活MAPK-ERK及PI3K-AKT進而促進HaCaT分化結(jié)果一致。研究[15-16]表明ERK 信號途徑 和 PI3K信號途徑參與了人皮膚角質(zhì)形成細胞增殖與分化的調(diào)節(jié),ERK1/2激活誘導(dǎo)KCs細胞分化,而PI3K激活維持分化KCs的存活,從而使得皮膚角質(zhì)形成細胞在增殖與分化之間達到平衡。 此外,IL-10還能激活JAK-STAT細胞途徑[1-2],提示IL-10對HaCaT細胞增殖及分化的影響機制可能涉及多條信號途徑,是多條信號途徑激活后的綜合效應(yīng),有待進一步研究。