小反芻獸疫和山羊痘活疫苗聯(lián)合免疫效果評(píng)價(jià)研究

張金學(xué)，董 偉*，王建軍，許開(kāi)云，張劍霞，盧 瑛

（ 1. 武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅 武威 733000 ； 2. 武威普康養(yǎng)殖有限公司，甘肅 武威 733000 ）

小反芻獸疫和羊痘是國(guó)家規(guī)定的一類傳染病，均是由病毒引起的急性接觸性傳染病。目前生產(chǎn)中沒(méi)有治療此病的特效藥物，加之兩種病的發(fā)病率和死亡率很高，可對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。因此，最有效、最經(jīng)濟(jì)、最主要的防控小反芻獸疫和羊痘疫病發(fā)生的措施仍是疫苗免疫[3-4]。根據(jù)近幾年武威市動(dòng)物疫病流行情況，生產(chǎn)中要求對(duì)小反芻獸疫、口蹄疫、布魯氏菌病、羊痘實(shí)行強(qiáng)制免疫。若按照傳統(tǒng)方式免疫，基層畜牧獸醫(yī)工作者的工作量和勞動(dòng)強(qiáng)度很大，不僅增加勞動(dòng)成本，降低工作效率，而且多次免疫注射會(huì)增加羊免疫應(yīng)激，降低動(dòng)物福利水平，還會(huì)影響羊肉品質(zhì)，進(jìn)而影響人類健康[5]。因此，為探索和創(chuàng)新肉羊疫苗綜合免疫優(yōu)化程序，進(jìn)一步提升防疫工作效率，本試驗(yàn)特開(kāi)展小反芻獸疫和羊痘疫苗的聯(lián)合免疫接種研究，為養(yǎng)殖場(chǎng)制定科學(xué)、合理、高效的疫苗免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本試驗(yàn)在甘肅省武威市涼州區(qū)武威普康養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選取生長(zhǎng)發(fā)育良好、無(wú)疾病、體重相近、未進(jìn)行疫苗免疫、2 月齡斷奶2 周的健康湖羊90 只，斷奶體重均在16.2～17.7 kg。

1.2.2 試驗(yàn)疫苗

山羊痘活疫苗（批號(hào)2021005-1）和小反芻獸疫活疫苗（批號(hào)2021035-2）均購(gòu)自新疆天康生物制藥有限公司。試驗(yàn)所用疫苗均在有效期內(nèi)。

1.2.3 檢測(cè)試劑

小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心；羊痘間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參試羊按體重分為3 組，每組30 只，各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。試驗(yàn)組Ⅰ試驗(yàn)羊僅免疫小反芻獸疫活疫苗，試驗(yàn)組Ⅱ僅免疫山羊痘活疫苗，試驗(yàn)組Ⅲ同時(shí)分點(diǎn)接種小反芻獸疫活疫苗和山羊痘活疫苗。各試驗(yàn)組于疫苗免疫當(dāng)日（0 d）頸靜脈采集血液樣本進(jìn)行母源抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性者方可作為試驗(yàn)羊。疫苗免疫后第7、14、21、28、90、210 d頸靜脈采血，3 000 r/min離心2 min，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，分析各疫苗免疫抗體水平以及兩種疫苗抗體間是否存在干擾以及干擾程度。

1.3.2 免疫方法（見(jiàn)表1）

表1 免疫方法Tab.1 Immune method

試驗(yàn)組Ⅰ：小反芻獸疫活疫苗免疫按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，滅菌生理鹽水稀釋為每頭份1.0 mL，頸部皮下注射。

試驗(yàn)組Ⅱ：山羊痘活疫苗免疫按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，滅菌生理鹽水稀釋為每頭份0.5 mL，尾根內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射。

試驗(yàn)組Ⅲ：小反芻獸疫活疫苗和山羊痘活疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫注射，免疫途徑與劑量同試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ。

1.3.3 飼養(yǎng)管理

為減少環(huán)境、飼養(yǎng)管理等因素對(duì)試驗(yàn)造成的影響，參試羊斷奶后全部轉(zhuǎn)入試驗(yàn)羊舍，2 周后進(jìn)行疫苗免疫。并由專人飼養(yǎng)管理，每天定時(shí)定量飼喂，自由飲水。

1.3.4 免疫副反應(yīng)觀察

疫苗免疫后7 d 內(nèi)，逐個(gè)觀察參試羊的免疫部位反應(yīng)及精神狀態(tài)、體溫、活動(dòng)、采食、飲水等情況，并進(jìn)行詳細(xì)記錄，統(tǒng)計(jì)免疫副反應(yīng)以測(cè)試使用疫苗的安全性能。一旦試驗(yàn)羊出現(xiàn)不良反應(yīng)，及時(shí)通知獸醫(yī)人員采取急救措施。

1.3.5 抗體檢測(cè)方法

1.3.5.1 小反芻獸疫抗體檢測(cè)

采用阻斷ELISA檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體，嚴(yán)格按照小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。檢測(cè)結(jié)果判定：陽(yáng)性血清阻斷率（PIPC）＞60，陰性血清阻斷率（PINC）＜40，檢測(cè)結(jié)果有效，否則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；阻斷率（PIS）＞50，抗體陽(yáng)性；PIS≤50，抗體陰性。

PIS=（100-樣本OD值/酶標(biāo)抗體平均OD值）×100（1）

1.3.5.2 羊痘血清抗體檢測(cè)

采用間接ELISA檢測(cè)羊痘病毒抗體，嚴(yán)格按照羊痘間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性血清孔OD450nm值＜0.2，陽(yáng)性血清孔OD450nm值＞0.6，檢測(cè)結(jié)果成立，否則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；OD450nm值≥0.25，抗體陽(yáng)性；OD450nm值≤0.2，抗體陰性；0.25＞OD450nm值＞0.20，陽(yáng)性可疑，重復(fù)檢測(cè)；若OD450nm值≥0.23，抗體陽(yáng)性，OD450nm值≤0.23，抗體陰性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)按照疫苗種類分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果均以抗體陽(yáng)性率表示，采用SPSS 18.0 軟件單因子方差分析法進(jìn)行差異性分析。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。根據(jù)國(guó)家規(guī)定，群體免疫抗體合格率達(dá)70%以上判定為群體疫苗免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗安全性觀察結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 疫苗安全性觀察結(jié)果Tab.2 Vaccine safety observations 單位：只

由表2可知，免疫后7 d內(nèi)，試驗(yàn)組Ⅰ試驗(yàn)羊未發(fā)現(xiàn)任何局部或全身不良反應(yīng)。疫苗免疫后1～2 d，試驗(yàn)組Ⅱ有7 只試驗(yàn)羊的接種部位出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，于第3 d 消退；組內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)熱、停食、死亡現(xiàn)象。疫苗免疫后1～2 d，試驗(yàn)組Ⅲ中4 只試驗(yàn)羊的羊痘疫苗接種部位出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，于第3 d消退；2只參試羊有輕微發(fā)熱反應(yīng)；組內(nèi)未出現(xiàn)停食、死亡現(xiàn)象。

2.2 小反芻獸疫疫苗免疫抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 小反芻獸疫疫苗免疫抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of detection of antibody to PPR vaccine

由圖1可知，試驗(yàn)羊在疫苗免疫后第7 d均產(chǎn)生抗體，單免（試驗(yàn)組Ⅰ）小反芻獸疫疫苗抗體陽(yáng)性率達(dá)56.7%，極顯著低于聯(lián)合免疫組（試驗(yàn)組Ⅲ，小反芻獸疫疫苗抗體陽(yáng)性率達(dá)83.3%）（P＜0.01）。免疫后第14、21、28 d，試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ的抗體陽(yáng)性率分別為73.3%、90.0%、100.0%和93.3%、100.0%、100.0%，抗體水平整體呈上升趨勢(shì)；免疫后14 d 時(shí)試驗(yàn)組Ⅲ試驗(yàn)羊抗體水平極顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ（P＜0.01），21 d 時(shí)試驗(yàn)組Ⅲ抗體水平顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ（P＜0.05），28 d 之后兩組小反芻獸疫疫苗抗體合格率差異不顯著（P＞0.05）。

試驗(yàn)組Ⅰ抗體水平在第28 d 達(dá)到峰值（100%），試驗(yàn)組Ⅲ在21 d 達(dá)到峰值（100%）；免疫后210 d 時(shí)，兩組抗體水平均有所下降，試驗(yàn)組Ⅰ為90.0%，試驗(yàn)組Ⅲ為93.3%，但均達(dá)到國(guó)家規(guī)定的疫苗免疫合格率（70%）標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 羊痘疫苗免疫抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖2）

圖2 羊痘疫苗免疫抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of antibody detection of sheep pox vaccine

由圖2可知，參試羊在疫苗免疫后第7 d均產(chǎn)生抗體，單免（試驗(yàn)組Ⅱ）羊痘疫苗抗體陽(yáng)性率達(dá)70%，極顯著高于聯(lián)合免疫（試驗(yàn)組Ⅲ，羊痘疫苗抗體陽(yáng)性率達(dá)30%）（P＜0.01）。免疫后第14、21、28 d，試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的抗體陽(yáng)性率分別為83.3%、100.0%、100.0% 和53.3%、76.7%、90.0%，表明抗體水平整體呈上升趨勢(shì)；第14 d 和21 d 時(shí)試驗(yàn)組Ⅱ抗體水平極顯著高于試驗(yàn)組Ⅲ（P＜0.01），28 d時(shí)試驗(yàn)組Ⅱ抗體水平顯著高于試驗(yàn)組Ⅲ（P＜0.05）。

試驗(yàn)組Ⅱ抗體水平在第21 d達(dá)到峰值（100.0%），試驗(yàn)組Ⅲ在28 d達(dá)到峰值（90.0%）；90 d時(shí)，兩組抗體水平均出現(xiàn)下降趨勢(shì)；到210 d 時(shí)試驗(yàn)組Ⅱ羊痘疫苗抗體合格率為76.7%，達(dá)到國(guó)家規(guī)定的疫苗免疫合格率（70%）標(biāo)準(zhǔn)以上，試驗(yàn)組Ⅲ為63.3%，未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

疫苗免疫后，動(dòng)物機(jī)體受到刺激會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其產(chǎn)物特異性抗體可抵抗細(xì)菌、病毒等病原微生物對(duì)機(jī)體造成的感染。實(shí)際肉羊生產(chǎn)中，常規(guī)免疫的疫苗種類有羊痘、小反芻獸疫、三聯(lián)四防、口蹄疫、布魯氏菌疫苗，羊群?jiǎn)为?dú)免疫小反芻獸疫疫苗或羊痘疫苗以及兩種疫苗同時(shí)免疫所生產(chǎn)的抗體消長(zhǎng)規(guī)律如何，兩種疫苗之間是拮抗作用還是促進(jìn)作用尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

本研究選擇的試驗(yàn)羊?yàn)?月齡斷奶2周且未進(jìn)行任何疫苗免疫的健康羊群，且羊痘和小反芻獸疫抗體檢測(cè)均為陰性，避免了疫苗免疫抗體的干擾以及母源抗體的影響。研究結(jié)果表明，羊痘和小反芻獸疫疫苗單苗免疫和聯(lián)合分點(diǎn)免疫臨床癥狀無(wú)明顯差異，各組試驗(yàn)羊均未出現(xiàn)發(fā)熱、厭食、死亡現(xiàn)象。各組試驗(yàn)疫苗免疫試驗(yàn)羊后均在第7 d產(chǎn)生抗體，21 d、28 d 左右抗體陽(yáng)性率達(dá)到高峰，90 d 后出現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)；兩種疫苗單獨(dú)免疫試驗(yàn)羊后，疫苗抗體合格率到210 d 時(shí)均在75%以上，達(dá)到國(guó)家規(guī)定的疫苗免疫合格率70%以上的標(biāo)準(zhǔn)。吳婷等[6]研究結(jié)果顯示，湖羊進(jìn)行羊痘疫苗免疫后第28 d 時(shí)，血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到高峰（99.1%），210 d時(shí)抗體陽(yáng)性率為79.1%，抗體水平合格率達(dá)到國(guó)家規(guī)定的免疫合格標(biāo)準(zhǔn)。田海芹等[7]研究表明，小反芻獸疫疫苗免疫試驗(yàn)羊28 d 時(shí)，抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，168 d時(shí)抗體陽(yáng)性率為95.65%。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

本研究中，兩種疫苗聯(lián)合分點(diǎn)免疫參試羊后，小反芻獸疫疫苗免疫效果比單獨(dú)免疫效果好，免疫抗體陽(yáng)性率在第7、14 d時(shí)極顯著高于單獨(dú)免疫，21 d時(shí)顯著高于單獨(dú)免疫；28 d之后兩組抗體水平差異不顯著，到210 d時(shí)抗體水平有所下降，但均達(dá)到國(guó)家規(guī)定的疫苗免疫合格率70%以上；而聯(lián)合分點(diǎn)免疫后的羊痘疫苗免疫效果比單獨(dú)免疫效果差，免疫抗體陽(yáng)性率在第7、14、21 d 時(shí)極顯著低于單獨(dú)免疫，28 d 時(shí)顯著低于單獨(dú)免疫；免疫后90 d 時(shí)兩組抗體水平均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，到210 d時(shí)，聯(lián)合免疫組試驗(yàn)羊抗體合格率僅為63.3%，未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。張海霞等[8]研究表明，小反芻獸疫、山羊痘二聯(lián)活疫苗對(duì)羊的免疫效果不理想，疫苗免疫后僅有小反芻獸疫抗體存在，羊痘抗體不存在。也有研究表明，小反芻獸疫疫苗和羊痘疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫羊后，羊痘疫苗的抗體陽(yáng)性率比小反芻獸疫疫苗抗體陽(yáng)性率低約15%[5,9-10]。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果顯示的兩種疫苗聯(lián)合分點(diǎn)免疫參試羊的免疫抗體消長(zhǎng)趨勢(shì)一致。徐雅萍等[11]、張大俊[12]研究表明，小反芻獸疫疫苗和羊痘疫苗同時(shí)分點(diǎn)注射后7～210 d，兩種疫苗的抗體合格率均在75%以上，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，與本研究結(jié)果不一致。

本研究結(jié)果表明，羊痘疫苗與小反芻獸疫疫苗聯(lián)合分點(diǎn)免疫，羊痘疫苗可促進(jìn)小反芻獸疫疫苗的免疫效果，而小反芻獸疫疫苗卻抑制了羊痘疫苗的免疫效果，且在免疫后210 d時(shí)其抗體合格率未能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。小反芻獸疫疫苗與山羊痘疫苗均屬于弱毒疫苗，當(dāng)兩種病毒同時(shí)感染宿主時(shí)，病毒間可能存在相互干擾的作用，一種病毒可抑制另一種病毒復(fù)制；或病毒與宿主細(xì)胞之間產(chǎn)生相互影響，從而導(dǎo)致兩種弱毒疫苗同時(shí)免疫宿主時(shí)產(chǎn)生相互干擾的現(xiàn)象[13-14]。

4 結(jié)論

通過(guò)綜合分析，羊痘疫苗與小反芻獸疫疫苗聯(lián)合分點(diǎn)接種的免疫操作程序無(wú)法在實(shí)際生產(chǎn)中大范圍推廣，若養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）剛發(fā)生小反芻獸疫疫情或受到小反芻獸疫疫情威脅時(shí)，可建議養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）采用羊痘疫苗和小反芻獸疫疫苗聯(lián)合分點(diǎn)接種的免疫操作程序，以增強(qiáng)小反芻獸疫疫苗的免疫效果。本研究結(jié)果同時(shí)也為有效預(yù)防和控制武威市小反芻獸疫疫情發(fā)生，制定合理的肉羊疫苗免疫程序提供科學(xué)依據(jù)。