哈茨木霉對商洛煙區(qū)植煙土壤細(xì)菌多樣性的影響

穆耀輝　任志超　李淑娥　張永峰　任天寶　張松濤　姬小明　王景　殷全玉　劉國順

摘要：探究哈茨木霉對植煙土壤細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的影響，為優(yōu)化輪作煙草根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、物種組成及土壤的可持續(xù)發(fā)展奠定了一定的基礎(chǔ)。采用大田試驗方法，設(shè)置CK（常規(guī)施肥）和T1（常規(guī)施肥+哈茨木霉菌劑7.5 kg/hm2）2個處理，通過高通量測序技術(shù)探究施用哈茨木霉對各處理土壤細(xì)菌多樣性、菌落結(jié)構(gòu)及理化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，哈茨木霉菌劑的施用降低了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的α多樣性指數(shù)，與常規(guī)施肥相比，增加了放線菌門（11.06％）的豐度，減少了變形菌門（4.03％）、綠彎菌門（2.28％）及酸桿菌門（1.71％）的豐度，土壤全氮和速效鉀含量顯著提高，分別提高14.2％和37.1％。表明在植煙土壤中施加哈茨木霉菌肥可進一步優(yōu)化植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力。

關(guān)鍵詞：木霉；根際土壤；細(xì)菌群落；多樣性；土壤理化性質(zhì)；高通量測序

中圖分類號S154.3文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0152-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.037

Effects of Trichoderma harzianum on Bacterial Diversity in Tobacco Growing Soil in Shangluo Tobacco Area

MU Yaohui1，REN Zhichao2，LI Shue1? et al

（1.Shangluo Company of Shaanxi Tobacco Company，Shangluo，Shaanxi? 726000;2.Tobacco College of Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan? 450000）

AbstractThe effects of Trichoderma harzianum on bacterial diversity and community structure in tobaccoplanting soil were studied，which laid a foundation for optimizing the bacterial community structure，species composition and sustainable development of soil in tobacco rhizosphere soil.A field experiment was conducted to investigate the effects of Trichoderma harzianum on soil bacterial diversity，colony structure and physical and chemical indexes by using highthroughput sequencing technology in CK （conventional fertilization） and T1 （conventional fertilization+Trichoderma harzianum 7.5 kg/hm2）.The application of Trichoderma harzianum decreased the α diversity index of soil bacterial community structure.Compared with conventional fertilization，Trichoderma harzianum increased the abundance of Actinobacteriota （11.06%），decreased the abundance of Proteobacteria （4.03%），Chloroflexi （2.28%） and Acidobacterioa （1.71%），and significantly increased soil total nitrogen and available potassium content by 14.2% and 37.1%，respectively.Studies have shown that the application of Trichoderma harzianum fertilizer in tobaccogrowing soil can further optimize the bacterial community structure in tobaccogrowing soil and improve soil fertility.

Key wordsTrichoderma;Rhizosphere soil;Bacterial community;Diversity;Soil physicochemical properties;Highthroughput sequencing

植物從土壤中汲取養(yǎng)分來完成各種生命活動，意味著土壤是影響甚至決定植物生長發(fā)育狀況的重要因素，但土壤本身必須發(fā)育到一定程度才能滿足植物的生長發(fā)育需要［1］。土壤微生物作為植物與土壤的橋梁，有促進土壤養(yǎng)分循環(huán)、凈化土壤污染、調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等作用［2-5］。人們通過研究土壤微生物的功能多樣性、群落結(jié)構(gòu)及物種種類多樣性來闡釋土壤生態(tài)系統(tǒng)與土壤微生物的關(guān)系。由于作物多年連作，生產(chǎn)管理措施不當(dāng)導(dǎo)致土壤營養(yǎng)流失、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)破壞、煙草植株發(fā)育不良等，成為制約我國煙草行業(yè)發(fā)展的重要因素。

木霉是自然界中的一類有益生防菌，據(jù)統(tǒng)計，木霉對18個屬30種的植物病原菌具有良好的生防效果，且具有分布廣、適應(yīng)性強及繁殖快等特點［6-8］，不僅對多種植物病原菌具有拮抗作用，還可以改善作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［9-10］。張麗榮等［11］在西瓜根際土壤中施加木霉制劑可顯著提高土壤中有益微生物的含量，有效改善了土壤根際微生態(tài)效應(yīng)。劉正洋等［12］通過施用木霉生物有機肥發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，白菜-甘藍(lán)連作體系產(chǎn)量明顯提高。扈進冬等［13］通過對小麥與哈茨木霉拌種處理發(fā)現(xiàn)土壤中病原真菌的相對豐度顯著降低。王義坤等［14］通過在連作土壤中施加哈茨木霉發(fā)現(xiàn)土壤根系酶活性及活力明顯提高，土壤鐮孢菌豐度顯著降低，對蘋果連作障礙的防控具有良好效果。目前，木霉在小麥、香蕉、棉花等［15-17］土壤微生物多樣性方面的研究已有不少報道，而對于煙草土壤微生物多樣性方面的研究鮮見報道。鑒于此，筆者通過高通量測序的方法對施用哈茨木霉菌劑及未施用哈茨木霉菌劑煙株的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行分析，探究哈茨木霉菌劑對商洛市植煙土壤微生物多樣性的影響，對煙草的生長發(fā)育及土壤的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

1材料與方法

1.1試驗材料供試煙草品種為云煙99，供試土壤類型為黏壤土，取自陜西省商洛市洛南縣，哈茨木霉Z-19菌劑由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科教園區(qū)微生物實驗室制備、保存。

1.2試驗設(shè)計采用隨機區(qū)組排列方法，設(shè)2個處理，重復(fù)5次。

處理①常規(guī)施肥；處理②常規(guī)施肥+哈茨木霉菌劑7.5 kg/hm2；常規(guī)施肥為煙草專用肥（N∶P∶K=12∶10∶23）7.5 kg/hm2+蚯蚓糞1 t/hm2+西洋復(fù)合肥（N∶P∶K=16∶6∶23）150 kg/hm2。

試驗于2020年2—10月在陜西省商洛市洛南縣進行，試驗田地勢平坦，排灌方便。所用哈茨木霉菌劑的質(zhì)量要求為活菌數(shù)≥20億mL，移栽時使用，與移栽水混勻后灌根即可。

1.3土壤取樣

在煙草移栽75 d時，避開雨天和過度干旱期。取樣方法參照文獻［18］，按照5點取樣法在每個處理選取10個取樣點，即每個重復(fù)2個取樣點，利用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm深，切割土壤中煙株的任何側(cè)根并挖出煙株的整個根部放于盆中，搖動根部用鏟子從根部去除土壤，采集2份盆中的土壤，一部分除去各種雜質(zhì)后混勻過2 mm篩并取5 g于10 mL無菌離心管中直接干冰運送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行土壤微生物多樣性檢測，剩余部分土壤放于密封袋內(nèi)快速運回實驗室-80 ℃保存并進行理化性質(zhì)分析。

1.4土壤理化性質(zhì)分析

測定方法參照文獻［19］，土壤全氮、全碳用全自動CN分析儀（vario MAX CN，德國）測定;硝態(tài)氮和銨態(tài)氮用全自動化學(xué)分析儀（Smartchem140，意大利）測定;土壤pH用電位法測定;速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定;速效鉀采用1 mol/L乙酸銨浸提-火焰光度計法測定。

1.5土壤微生物測定分析方法

使用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒對土壤微生物群落進行DNA的提取，并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。測序流程分為PCR擴增、PCR產(chǎn)物的混樣與純化、文庫的構(gòu)建3部分。對細(xì)菌V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，其引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），之后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃保存。

1.6數(shù)據(jù)分析采用 DPS 7.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，用R語言工具制圖。

2結(jié)果與分析

2.1哈茨木霉菌劑對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響由表1可知，與CK相比，T1土壤的全碳、銨態(tài)氮和速效磷含量分別提高了10.8％、3.3％、2.1％且不存在顯著差異，T1土壤的全氮、硝態(tài)氮及速效鉀含量分別提高了16.7％、91.3％、59.0％且與CK存在顯著差異。說明哈茨木霉菌劑的施用可顯著提高土壤全氮、硝態(tài)氮及速效鉀的含量，雖未顯著提高土壤全碳、銨態(tài)氮和速效磷的含量，但也稍有提高。

2.2哈茨木霉菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1樣本測序結(jié)果。

Veen圖表示土壤樣本中的相同物種及差異物種，抽平后檢測到土壤樣本的微生物總OTUs數(shù)為2 293。由圖1可知，CK和T1共有的OTUs總數(shù)為1 958，各處理所含的特有OTUs總數(shù)分別為171和164，分別占土壤樣本OTUs總數(shù)2 293的7.46％和7.15％。總體來看，施加哈茨木霉后煙株根際土壤的 OTUs 總數(shù)比未施加哈茨木霉的有所降低。

稀釋曲線在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的調(diào)查中常用來分析所取樣本量是否足夠及估計樣本群落結(jié)構(gòu)的豐富度。即隨機抽取一定數(shù)量的序列作為橫坐標(biāo)，α多樣性指數(shù)值為縱坐標(biāo)，通過觀察曲線的平穩(wěn)程度來判斷序列數(shù)量是否符合該試驗。隨著土壤樣品量的增加，可能出現(xiàn)測序檢測到的物種種類隨之增加的狀況，由圖2可知，當(dāng)序列數(shù)達(dá)5 000時，各土壤樣本曲線均居于平緩，并不隨著土壤樣本量的加大而顯著增加，說明土壤樣本細(xì)菌的總DNA測序深度足夠，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)置信度高，此次分析結(jié)果可靠。

2.2.2土壤細(xì)菌群落的α多樣性。

α多樣性指數(shù)分析是通過一些統(tǒng)計學(xué)指數(shù)來分析并評估細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐度與多樣性，Coverage指數(shù)用來描述樣本菌落的覆蓋率，即該次測序是否代表真實狀況，Chao1指數(shù)反映了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的均勻性。由表2可知，各個樣本細(xì)菌的Coverage均接近100％，表明此次測序反映了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的真實性。Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)表現(xiàn)為CK＞T1，而Simpson指數(shù)與之相反，由此可知，哈茨木霉的施用降低了植煙土壤群落結(jié)構(gòu)的豐度和均勻性；從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐度來看，雖然CK和T1處理的Chao1指數(shù)不存在顯著差異，但數(shù)值上還是出現(xiàn)了差距，即降低了8.0％，施用哈茨木霉的土壤群落結(jié)構(gòu)豐度要小于常規(guī)施肥的土壤群落結(jié)構(gòu)豐度；從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的均勻性來看，各處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)存在顯著差異且施用哈茨木霉的土壤群落結(jié)構(gòu)均勻性顯著小于常規(guī)施肥的土壤群落結(jié)構(gòu)均勻性，Shannon指數(shù)降低了11.8％，Simpson指數(shù)增加了258.8％，說明哈茨木霉菌劑的施用影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.2.3土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。

與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對后，可以得到土壤樣本細(xì)菌在門水平下Top10的物種分布圖。由圖3可知，施用哈茨木霉的土壤與常規(guī)施肥的土壤群落結(jié)構(gòu)在門水平上基本一致，但相對百分比存在差異。相對豐度較高的放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）為2個土壤樣本的優(yōu)勢物種，相對豐度達(dá)80％以上。放線菌門（Actinobacteriota）在施用哈茨木霉的土壤樣本中的相

對含量高于常規(guī)施肥的土壤樣本，分別為42.43％和53.29％，提高了10.86百分點；對于變形菌門（Proteobacteria），T1處理相比CK處理的相對豐度明顯降低了4.03％；各個處理綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度表現(xiàn)為T1＞CK，T1處理的相對豐度相比CK處理分別降低了2.28％和1.71％。

Heatmap圖根據(jù)土壤樣本間豐度進行分塊聚類，通過顏色的變化來反映土壤樣本在不同水平上的相關(guān)性，紅色越深說明在該水平上土壤細(xì)菌生長所受到的促進作用越強，相對豐度也隨之越高，藍(lán)色越深說明在該水平上土壤細(xì)菌生長所受到的促進作用越弱，相對豐度也隨之越低。由圖4可知，CK處理對變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）的促進作用比T1處理有所增強，對放線菌門（Actinobacteriota）的促進作用比T1處理有所減弱。

2.2.4土壤細(xì)菌群落主成分分析。

PCoA分析是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，用來分析土壤樣本群落組成的相關(guān)性，如果在PCoA圖中的距離越近，則土壤樣本的物種組成越相似。由圖5可知，PC1 和 PC2 解釋率分別為69.67％和12.53％，CK處理主要集中在坐標(biāo)軸左側(cè)，T1處理主要集中在坐標(biāo)軸右側(cè)，說明2組土壤樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。由圖6可知，在 PC1 軸上 CK和T1處理之間的距離較近，說明哈茨木霉的施用改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；CK和T1處理之間的箱形長度無明顯差異，說明2個處理的重復(fù)性一致。

2.2.5土壤細(xì)菌群落LEfSe分析。

LEfSe根據(jù)分類學(xué)組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析（LDA），以此找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。對CK和T2組土壤樣本進行LEfSe多級物種差異判別分析來檢測具有顯著差異的微生物，并采用LDA線性判斷分析來評估每個物種對差異效果影響的程度。由圖7可知，在CK土壤樣本中，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Sumerlaeota、Abditibacteriota及Bdellovibrionota顯著富集；在T1土壤樣本中，放線菌門（Actinobacteriota）、Dependentiae及脫硫菌門（Desulfobacterota）發(fā)生顯著富集。由圖8可知，變形菌門（Proteobacteria）對CK組土壤的群落結(jié)構(gòu)影響最大，而放線菌門（Actinobacteriota）對T1組的土壤群落結(jié)構(gòu)影響最大。

2.2.6優(yōu)勢菌門與土壤化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析。優(yōu)勢菌門與土壤化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)用來表明環(huán)境因子與物種之間的相關(guān)程度，挑選相對豐度前10的物種與土壤理化指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，放線菌門與全氮和速效鉀的正相關(guān)程度最明顯為0.38；變形菌門與速效鉀的負(fù)相關(guān)程度最明顯為-0.62；綠彎菌門和酸桿菌門與銨態(tài)氮的負(fù)相關(guān)程度最明顯分別為-0.60和-0.67。

3討論

土壤細(xì)菌的物種多樣性指數(shù)可反映土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性［20］。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用哈茨木霉菌劑的土壤樣本的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均存在顯著差異，Chao1指數(shù)不存在顯著差異，但數(shù)值上還是出現(xiàn)了差距，說明哈茨木霉菌劑的施用降低了土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。從土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成可以看出，施用哈茨木霉的土壤與常規(guī)施肥的土壤群落結(jié)構(gòu)在門水平上基本一致，相對豐度較高的放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacterioa）為2個土壤樣本的優(yōu)勢物種，這與楊菁等［21］研究結(jié)果一致。放線菌是一類抗生素生產(chǎn)菌，通過寄生于植物體內(nèi)來讓植物產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，從而提高植物的抗病性［22］。同時，放線菌門常以孢子形態(tài)共存于土壤之中，對植物供給養(yǎng)分，促進植物生長發(fā)育［23］。該研究表明，施用哈茨木霉會導(dǎo)致土壤肥力不同程度的提高，其中施用哈茨木霉的土壤中放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度顯著提高，通過分析表明放線菌門（Actinobacteriota）與土壤全氮和速效鉀的含量呈正相關(guān)關(guān)系，從而導(dǎo)致土壤全氮和速效鉀含量的顯著提高；放線菌門（Actinobacteriota）會產(chǎn)生抑菌物質(zhì)來提高煙株的抗病性且供給更多的養(yǎng)分來促進煙株生長發(fā)育。變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）在土壤群落結(jié)構(gòu)中相對豐度減少可能是因為放線菌門（Actinobacteriota）相對豐度的增加導(dǎo)致土壤中部分養(yǎng)分被競爭，從而相對豐度減少［24］。施用哈茨木霉也會使其他土壤肥力指標(biāo)的含量不同程度的增加，這是因為施用哈茨木霉可促進土壤中有機質(zhì)的形成與轉(zhuǎn)化從而提高土壤肥力［25］。

4結(jié)論

該研究結(jié)果表明，施用哈茨木霉菌劑可顯著改變土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，施加哈茨木霉后植煙土壤細(xì)菌群落物種多樣性降低，在門水平上的優(yōu)勢菌群中放線菌門（Actinobacteriota）的含量顯著增加，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）的含量降低，土壤全氮和速效鉀含量顯著提高。哈茨木霉的施用優(yōu)化了植煙土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高了土壤肥力。研究結(jié)果揭示了哈茨木霉菌劑對商洛市植煙土壤微生物多樣性的影響，這為優(yōu)化輪作煙草根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、細(xì)菌群落物種組成及土壤的可持續(xù)發(fā)展奠定了一定的基礎(chǔ)。

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基金項目中國煙草總公司陜西省公司科技項目（2021611000270042）。

作者簡介穆耀輝（1970—），男，陜西商洛人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事煙草生產(chǎn)管理技術(shù)研究。*通信作者，副教授，博士，從事煙草資源微生物利用與土壤保育研究。

收稿日期2022-05-16