接種褐環(huán)乳牛肝菌對樟子松及油松根際土壤細(xì)菌群落的影響

包潤澤　張星　姚慶智*

摘要：［目的］探究褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）對樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）和油松（P.tabulaeformis）根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。［方法］利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，分析2種松樹的根際土壤在接種S.luteus與未接種處理下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，同時結(jié)合土壤有機(jī)碳（C）、含水量（WC）、速效磷（P）和速效氮（N）進(jìn)行相關(guān)研究。［結(jié)果］接種S.luteus后2種松樹根際土壤中的有機(jī)碳、含水量、速效磷和速效氮含量均大于對照組。綜合細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)及OTU-Venn發(fā)現(xiàn)，接種S.luteus后的樟子松和油松根際土壤細(xì)菌相對豐度與對照組存在顯著差異（P<0.05）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，接種S.luteus顯著影響了根際土壤細(xì)菌的豐富度，且有機(jī)質(zhì)和物種數(shù)量、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)呈顯著正相關(guān)；此外，土壤含水量也與土壤細(xì)菌數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。與對照組相比，接種S.luteus后根際土壤中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度均顯著提高，優(yōu)勢屬由原來的假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）轉(zhuǎn)變?yōu)樗釛U菌屬（bacterium RB41）。接種S.luteus后土壤細(xì)菌豐度上升的屬與其所對應(yīng)的pH均呈負(fù)相關(guān)，表明樟子松和油松的生長喜好更偏向酸性環(huán)境。［結(jié)論］接種S.luteus不僅影響了根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且有效改善土壤中養(yǎng)分的供應(yīng)能力，為后續(xù)研究樟子松和油松退化機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：褐環(huán)乳牛肝菌；土壤細(xì)菌；樟子松；油松

中圖分類號Q939.96文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.036

Effects of Inoculation with Suillus luteus on Rhizosphere Soil Bacterial Communities of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis

BAO? Runze，ZHANG Xing，YAO Qingzhi

（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia? 010018）

Abstract［Objective］To investigate the effect of inoculation with the Suillus luteus on the interrhizosphere soil bacterial community structure of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis.［Method］Using Illumina MiSeq highthroughput sequencing technology，we compared the bacterial community structure of the interroot soil of two pine trees under inoculation with S.luteus and without inoculation treatment，and also correlated with soil organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N）.［Result］The contents of organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N） in the rhizosphere soil of the two pine trees after inoculation with S.luteus were higher than those of the uninoculated control.Inoculation of S.luteus significantly affected the abundance of rhizosphere soil bacteria.The organic matter in the rhizosphere soil of the two pines was significantly positively correlated with the number of bacterial species，Shannon index，and ACE index in the rhizosphere soil，and the soil water content was also positively correlated with the number of soil microorganisms.The relative abundances of Proteobacteria，Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes，and Verrucomicrobia were significantly increased in the rhizosphere soils of the two pines after inoculation with S.luteus.The dominant genus changed from Pseudarthrobacter to bacterium RB41.The genus of increased abundance after inoculation with S.luteus was negatively correlated with its corresponding pH value.［Conclusion］Inoculation with S.luteus not only affected the bacterial community structure of rhizosphere soil，but also effectively improved the nutrient supply capacity of soil，which provided a theoretical basis for the subsequent study of degradation mechanism of P.sylvestris and P.tabulaeformis.

Key wordsSuillus luteus;Soil bacteria;Pinus sylvestris var.mongolica;Pinus tabulaeformis

根際作為植物根系與土壤間進(jìn)行能量和物質(zhì)交換的直接界面，是微生物棲息的主要區(qū)域，被認(rèn)為是地球上最活躍的界面之一［1-4］。近年來，根際微生物組有關(guān)能促進(jìn)植物宿主營養(yǎng)吸收、病蟲害抵抗及脅迫適應(yīng)的巨大潛力在相關(guān)研究中得到證實(shí)。根際微生物組內(nèi)及與其他微生物組間的互作也影響微生物組的組裝［5］。微生物間互作方式包括營養(yǎng)依賴（nutritional interdependencies）、協(xié)助擴(kuò)散（enhanced dispersal）及群體感應(yīng)（quorum sensing）等類型。其中特定細(xì)菌以真菌菌絲作為媒介，即利用所謂的“真菌高速公路（fungal highway）”來提高其在土壤環(huán)境中的遷移速度，是微生物間協(xié)助擴(kuò)散的典型形式［6-8］。這一互作策略在構(gòu)建土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。同時研究發(fā)現(xiàn)菌根輔助細(xì)菌（mycorrhiza helper bacteria，MHB）可以通過影響真菌菌絲的肌動蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)而導(dǎo)致菌絲形態(tài)的改變并提高菌絲延伸速度以達(dá)到提高侵染率的效果［9］。另外Kataoka等［10］利用5種外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi，EMF）對2種MHB的選擇性輔助效應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MHB具有真菌選擇性且作用機(jī)制存在差異。

隨著生態(tài)建設(shè)的逐步深入，常綠針葉樹種成為內(nèi)蒙古地區(qū)造林、園林綠化的主要樹種，在生態(tài)建設(shè)和環(huán)境恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。樟子松（P.sylvestris var.mongolica）、油松（P.tabulaeformis）屬深根性樹種，其適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐寒、抗瘠薄，是我國特有樹種，也是內(nèi)蒙古西部地區(qū)優(yōu)良綠化樹種［11］，且在干旱及半干旱地區(qū)對水源涵養(yǎng)和水土保持的意義重大［12-13］，隨著苗木樹齡增長和環(huán)境因子影響，目前油松和樟子松人工林面臨林分環(huán)境變差、土壤肥力下降、林地生產(chǎn)力衰退等問題［14-15］，嚴(yán)重影響城市綠化觀賞價值和防護(hù)林的生態(tài)價值。

EMF在改善植物根際微環(huán)境及促進(jìn)宿主植物生長等方面發(fā)揮重要作用［16］。因此，筆者以接種S.luteus 5年后的樟子松和油松根際土壤為研究對象，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究接種EMF對針葉樹根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，旨在為保障樟子松林和油松林的健康生長提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗地概況

研究區(qū)域位于內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣，該地區(qū)地處陰山山脈，大青山南部（115°56′～115°60′E，42°25′～42°33′N），海拔為1 023～1 035 m。年平均降水量為410 mm，屬于半干旱地區(qū)。

1.2樣品的采集與處理

供試菌株Suillus luteus L22（GenBank登錄號：OL872261）由筆者所在實(shí)驗室前期分離自樟子松根系，菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后制備成液體菌劑備用；供試苗木選自2012年內(nèi)蒙古盛樂國際生態(tài)示范區(qū)苗圃，2年生的裸根苗，采用蘸根法接種S.luteus菌劑，共4種處理方式：接種S.luteus菌劑的樟子松bTZD；接種S.luteus菌劑的油松bTYD；不接種S.luteus菌劑的樟子松bTZM；不接種S.luteus菌劑的油松bTYM。于2017年5月上旬在每個處理樣地設(shè)計3個樣方（20 m×20 m），每個樣方中選取5棵樟子松和油松作為重復(fù)（胸徑為15 cm左右），每棵樟子松和油松選取3個方位，用無菌刷輕刷樣品根系，并收集根際土于無菌塑封袋，將每個樣方的5份根際土壤樣品均勻混合成1份樣品，最終得到12份土樣。新鮮土樣過10目鋼篩后立即貯藏于-80 ℃冰箱內(nèi)備用，用于后續(xù)檢測。

1.3試驗方法

1.3.1土壤DNA的提取與高通量測序。土壤DNA提取和測序分析在諾禾致源公司Illumina MiSeq PE250平臺進(jìn)行。

1.3.2土壤理化性質(zhì)的測定。土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、速效氮和速效磷測定參考《土壤理化分析與剖面描述》［17］。

1.4數(shù)據(jù)分析

使用FLASH、Qiime及Mothur軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到有效序列?；赨parse在相似水平為97%的OTU進(jìn)行聚類分析。用Mothur軟件分析樣品的Alpha多樣性。利用SPSS 20.0分析群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性，利用CANOCO 5.0分析環(huán)境因子對細(xì)菌群落的影響；利用Praphpad Prism 8對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2結(jié)果與分析

2.1接種S.luteus對樟子松和油松根際土壤理化性質(zhì)的影響

與未接種菌劑的樟子松和油松相比，bTYD、bTZD處理的根際土壤含水量、有機(jī)碳、速效磷、速效氮含量較高，此外，接種菌劑后的樟子松和油松根際土pH有所降低。表明S.luteus在樟子松和油松根際土壤的能量流動和養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮了重要作用，同時也極大地促進(jìn)了養(yǎng)分循環(huán)和關(guān)鍵元素的利用率（表1）。

2.2接種S.luteus對樟子松和油松根際土細(xì)菌群落的影響

不同處理下根際土壤細(xì)菌的分析（圖1）表明，4個樣品共獲得7 853個細(xì)菌OTU，bTYD、bTZD、bTZM和bTYM細(xì)菌特有OTU數(shù)分別為304、262、795和202，表明接種后的油松根際土特有細(xì)菌OTU數(shù)大于對照組，而接種前的樟子松特有細(xì)菌OTU數(shù)遠(yuǎn)大于接種后，說明接種菌劑前后的細(xì)菌豐度有較大差異。

2.3Alpha多樣性

對4種處理下的根際土壤樣品進(jìn)行了

16S rDNA多樣性分析，各土樣的細(xì)菌Coverage指數(shù)均高達(dá)

98%以上，說明該研究樣品文庫測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣本中微生物的真實(shí)情況。對照組的Simpson指數(shù)無顯著變化（P>0.05）。從圖2可以看出，有機(jī)質(zhì)和物種數(shù)量、Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），根際土壤含水量也與土壤微生物數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。表明接種S.luteus顯著影響了根際土壤細(xì)菌的豐富度（P<0.05）。

2.4土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在門分類水平上，與對照組相比，bTYD、bTZD處理組根際土壤中擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度均顯著增加（P<0.05）；而絲狀菌門（Actinomycota）、酸桿菌門（Acidobacteria）、古細(xì)菌門（Archaea）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度顯明顯降低（P<0.05）（圖3）。

在屬水平上，在bTYD、bTZD處理組中，孢菌屬（Sphingomonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）、貪噬菌屬（Variovorax）、地桿菌屬（Pedobacter）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、單孢菌屬（Terrimonas）、馬賽菌屬（Massilia）、溶桿菌屬（Lysobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）的相對豐度顯著增大，而亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、隱蓋氏菌屬（Gaiella）和微枝形桿菌屬（Microvirga）的相對豐度明顯降低。此外，水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）只有在bTZD處理組的根際土壤樣品中被檢測到，相對豐度為0.69%。瘤胃球菌（Ruminococcaceae UCG-005）只在bTYD處理組的根際土壤樣品中被檢測到，相對豐度為0.36%（圖4）。

2.5bTYD、bTZD主要屬與理化性質(zhì)相關(guān)性

總體來看，接種后的油松根際土壤細(xì)菌群落中，G55、Bacillu、Streptomyces、RB41、Microvirga和Solirubrobacter與含水量（WC）、速效磷（AP）、有機(jī)質(zhì)（SOC）、速效氮（AN）呈正相關(guān)，其中RB41與AP、Solirubrobacter和SOC及AN之間呈極顯著關(guān)系（P<0.01）（圖5）。而Pseudomonas、Lysobacter、Ramlibacter和Teeeimonas的豐度在接種S.luteus后呈下降趨勢。此外，豐度上升的屬與pH呈負(fù)相關(guān)。

由圖6可知，Steroidobacter、Mesorhizobium、Tardiphaga、Rhizomicrobium、Aquicella、Pseudohongiella、Hirschia、Terrimonas、Niastella與SOC、WC、AN和AP呈顯著正相關(guān)（P<0.01）。而unidentified Planctomycetaceae在處理組bTYD、bTZD中的豐度呈下降趨勢。豐度上升的屬與pH呈負(fù)相關(guān)，綜合以上結(jié)果猜測樟子松可能更適應(yīng)在酸性環(huán)境下生長。

2.6環(huán)境因素相關(guān)分析（RDA分析）

物種多樣性指數(shù)與土壤理化因子的RDA（redundancy analysis）分析結(jié)果顯示，軸1（RDA1）和軸2（RDA2）對土壤細(xì)菌豐度與土壤理化因子關(guān)系的累計解釋量為64.05%，能真實(shí)有效地反映土壤細(xì)菌群落和5個土壤理化因子的梯度變化。由圖7可知，64.05%的群落結(jié)構(gòu)信息可由這5個環(huán)境因子解釋，土壤理化因子對細(xì)菌群落變異的解釋率分別為77%、79%、77%、33%、14%，其中pH、WC、SOC的解釋率為極顯著（P<0.01），可見pH、有機(jī)質(zhì)和土壤含水量是影響物種多樣性指數(shù)變化的主要因子。此外，與bTYD、bTZD處理組根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成高度相關(guān)的環(huán)境因子是AP，且為正相關(guān)。結(jié)果表明主要環(huán)境因素影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。

3討論

土壤速效養(yǎng)分能夠很好地反映土壤養(yǎng)分的存在狀況。該研究結(jié)果表明，接種S.luteus能夠提高速效養(yǎng)分在土壤中的積累，樟子松和油松根際土壤中速效氮較對照分別增加了54.76%和54.40%，速效磷較對照分別增加了58.49%和55.56%，土壤中速效氮、速效磷與土壤肥力的相關(guān)性較大，同時在保障植株正常生長發(fā)育方面起到重要作用。速效氮、速效磷含量顯著提升是因為EMF能夠直接或間接地活化土壤中的固定養(yǎng)分，促進(jìn)土壤中難溶性磷、鉀的溶解和釋放，促進(jìn)土壤中營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化為植物可吸收的形態(tài)，從而顯著提高了速效氮和速效磷的含量，提高了土壤速效養(yǎng)分的供應(yīng)能力，改善了土壤中養(yǎng)分的供應(yīng)狀況，增加土壤肥力。且S.luteus還能產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)，刺激和調(diào)節(jié)作物生長，能激發(fā)土壤中固定的鈣、鋅等微量元素，使植物生長健壯，營養(yǎng)狀況得到改善［18］。與此同時，速效磷還與樟子松和油松根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，這可能是由于大部分解磷細(xì)菌為EMF的相關(guān)輔助細(xì)菌，接種S.luteus后其與土壤中的解磷菌互利共生，在提高解磷能力的同時也對土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生了影響［19］。在后續(xù)研究中，可重點(diǎn)關(guān)注微生物網(wǎng)絡(luò)互作，進(jìn)一步對外生菌根的促生機(jī)理開展深入探究。

植物根際進(jìn)行大量的物質(zhì)交換和能量交換，而根際微生物多樣性也與土壤肥力有顯著相關(guān)性，所以根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度是檢測土壤健康及質(zhì)量變化的關(guān)鍵指標(biāo)［20-21］。所以研究不同促生菌接種條件下，植物根際土壤微生物數(shù)量的變化規(guī)律，對于探索植物對土壤的作用過程和促生機(jī)理具有重要作用［22］。Deng等［23］研究發(fā)現(xiàn)施加微生物菌劑會顯著影響微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)，這與該試驗的結(jié)果相一致，可能是接種S.luteus后其次級代謝產(chǎn)物對一部分細(xì)菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)是分析和說明微生物多樣性的關(guān)鍵指數(shù)，可以反映樣本微生物的群落結(jié)構(gòu)差異。在該試驗中，接種S.luteus處理與根際細(xì)菌豐富度和多樣性呈正相關(guān)關(guān)系，這在一定程度上反映出接種S.luteus菌劑使得樟子松根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高。土壤微生物中以細(xì)菌體量最大，種類豐富，所以生物量也高；bTYD、bTZD處理組根際土壤細(xì)菌多樣性提高，同時土壤關(guān)鍵營養(yǎng)元素含量升高，表明根際土壤肥力提升，其原因可能是一些植物促生菌影響了植物根系原本的代謝狀態(tài)，導(dǎo)致根際微環(huán)境發(fā)生改變，最終使得根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在變化過程中，根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時優(yōu)勢菌群相對穩(wěn)定。由此可知，促生菌在植物定殖后，可以在保證微生物群落健康穩(wěn)定的情況下發(fā)生改變，進(jìn)而改善土壤環(huán)境微生態(tài)和土壤肥力。此外，接種S.luteus對樟子松、油松根際微生物的影響中，變形菌門微生物反應(yīng)較為敏感，而土傳致病菌的重要組成部分為變形菌門，因此推測褐環(huán)乳牛肝菌有拮抗病原菌的能力［24］。

4結(jié)論

與對照組相比，接種S.luteus后根際土壤中Proteobacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度均顯著提高，優(yōu)勢屬由原來的Pseudarthrobacter轉(zhuǎn)變?yōu)閎acterium RB41。土壤中的速效養(yǎng)分含量提高；并發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)和物種數(shù)量、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)呈顯著正相關(guān)。該試驗結(jié)果表明EMF對供試苗木的根際土壤細(xì)菌種群的多樣性和種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，具體表現(xiàn)為一些細(xì)菌種類的增多、減少和數(shù)量上的豐富，而發(fā)生變化的細(xì)菌種類還有待進(jìn)一步確定。該研究為提高人工林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，維持樟子松、油松人工林健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展提供新思路。

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基金項目內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目（2020MS03044）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目（2019GG002）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊項目（TD202103）。

作者簡介包潤澤（1998—），男，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事林業(yè)土壤微生物學(xué)研究。

收稿日期2022-02-27