玉米品種真實性SSR分子檢測體系優(yōu)化

林顯鳳　羅友明　尚玥　趙長坤　龔輝　楊騰　白體坤　毛若涵　李仕偉　游宇

摘要 對南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的2份玉米品種，隨機(jī)選用GB/T 39914—2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標(biāo)記檢測 玉米》中的12個SSR位點，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測法、變性PAGE銀染檢測法和毛細(xì)管電泳分析法，分析了不同的擴(kuò)增程序、儀器設(shè)備和反應(yīng)體系等對PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響。結(jié)果表明：60 ℃退火溫度和novoprotein Taq DNA聚合酶有利于玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測；2種PCR擴(kuò)增儀對擴(kuò)增結(jié)果并無較大區(qū)別。60 ℃-PCR1-E1，即60 ℃退火溫度，PCR擴(kuò)增儀1［TP-96A（F）］，novoprotein Taq DNA聚合酶，毛細(xì)管電泳法相結(jié)合為最優(yōu)組合，可作為四川品種真實性快速檢測候選方法。

關(guān)鍵詞 SSR標(biāo)記；玉米；真實性；檢測體系

中圖分類號 S513 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）06-0093-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.023

Optimization of SSR Molecular Detection System for Maize Variety Authenticity

LIN Xian－feng1，2， LUO You－ming3， SHANG Yue2 et al

（1.Nanchong Academy of Agricultural Sciences， Nanchong， Sichuan 637000;2.Seed Quality Supervision and Inspection Station of Nanchong， Nanchong， Sichuan 637000;3.Seed Administrative Station of Nanchong， Nanchong， Sichuan 637000）

Abstract The 2 maize varieties provided by Nanchong Academy of Agricultural Sciences.12 SSR loci were selected from GB/T 39914-2021Variety Genuineness and Purity Testing of Main Crops with SSR Markers－Maize. Different methods including agarose gel electrophoresis， denaturing PAGE and capillary electrophoresis were used to analyze the effects of instruments， equipment and reaction system on the quality of PCR products. 60 ℃ annealing temperature and Novoprotein Taq DNA polymerase were more conducive to the detection of SSR markers for maize variety authenticity;There was no significant difference between the two PCR amplification instruments. 60 ℃－PCR1－E1， i.e. 60 ℃ annealing temperature， novoprotein Taq DNA polymerase and PCR1 amplification instrument ［（TP－96A （F）］ were the best combination， which could be used as candidate methods for variety authenticity detection in Northeast Sichuan.

Key words SSR marker;Maize;Authenticity;Detection system

玉米（Zea mays Linn.）是全球重要的糧食和飼料作物及工業(yè)生產(chǎn)原材料［1］，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著巨大的影響作用［2］。隨著我國玉米育種技術(shù)的更新?lián)Q代，審定品種數(shù)量呈現(xiàn)“井噴式”增長，但遺傳基礎(chǔ)卻越來越狹窄［3］，以及玉米種子經(jīng)營渠道多、亂、雜，各地普遍存在以假充真、以劣充優(yōu)的現(xiàn)象，嚴(yán)重限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，使許多農(nóng)戶和經(jīng)濟(jì)組織遭受極大的經(jīng)濟(jì)損失［4-5］。玉米品種真實性和純度檢測的方法可以根據(jù)原理的不同，通過形態(tài)法、生理生化法、物理化學(xué)法、細(xì)胞學(xué)法、分子生物學(xué)法進(jìn)行鑒定；還可以根據(jù)檢驗對象的不同分為種子測定法、植株測定法、幼苗測定法；還可以根據(jù)檢驗場所的不同分為田間小區(qū)種植鑒定和室內(nèi)檢驗等［6］。國內(nèi)一般采用田間小區(qū)種植鑒定和室內(nèi)檢驗作為后控［6］。傳統(tǒng)的品種真實性鑒定有形態(tài)鑒定法和田間小區(qū)種植鑒定法，這2種方法存在費(fèi)工、費(fèi)時、鑒定周期長、費(fèi)用高等缺點，且這2種方法受環(huán)境和人為影響較大，鑒定者的觀察經(jīng)驗也制約著鑒定的準(zhǔn)確性［7］。用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別植物品種真實性［8-11］，具有檢測速度快，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，操作簡單，且不易受季節(jié)和環(huán)境變化影響等特點［12］，是一種快速、精準(zhǔn)鑒定品種真實性的有效方法［13］。微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeats，SSR），是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序列［14］，其重復(fù)單位為1～6個核苷酸，由10～20個重復(fù)單位串聯(lián)組成［15］。SSR標(biāo)記呈共顯性遺傳，可分辨出雜交種子的純合體和雜合體，每個位點均有許多等位形式，多態(tài)性高，結(jié)果重演性和穩(wěn)定性高，是目前較受歡迎的分子標(biāo)記技術(shù)［16-19］ 。

檢測SSR PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果的方法大致有以下5種：①瓊脂糖凝膠電泳檢測［20］；②QIAGEN 瓊脂糖毛細(xì)管電泳檢測［21］；③PAGE-放射自顯影檢測；④利用PAGE-銀染法進(jìn)行檢測［22］；⑤利用全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析［23-24］。目前已有學(xué)者利用瓊脂糖凝膠電泳SSR分子檢測鑒定出玉米品種真實性和純度檢測最適宜的部位［25］。筆者選?、?、④、⑤3個方法分析擴(kuò)增程序、儀器設(shè)備和反應(yīng)體系等因素對四川玉米品種真實性SSR分子測定結(jié)果質(zhì)量的影響，篩選出適宜的試驗條件以適應(yīng)四川目前真實性室內(nèi)分子檢測工作開展的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米種子樣品，由南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供。共2個種子樣品，分別為南N2142、南W816。

植物基因組DNA提取試劑盒（Aidlab），Taq DNA聚合酶：novoprotein（E1）、TIANGEN（E2）、四通道卡夾（Bioptic）。

智能人工氣候箱（RTOP-1000Y）；研磨儀（YMY200）；PCR擴(kuò)增儀1（TP-96A（F））；PCR擴(kuò)增儀2（BIO-RAD）；微量紫外分光光度計（TP-L-1000）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（BIOTOP）；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（BIO-RAD）；熒光毛細(xì)管電泳設(shè)備（Bioptic-Qsep400）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。

采取對玉米種子進(jìn)行發(fā)芽試驗，利用植物葉片直接提取的方法，每個試樣取5～7粒種子的葉片混株樣品，使用研磨儀進(jìn)行研磨，用DNA提取試劑盒提取玉米全基因組DNA，方法詳見試劑盒說明書。提取的DNA用微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋到50 ng/μL。

1.2.2 PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)采用20 μL體系，2×Taq PCR Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。引物使用GB/T 39914—2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標(biāo)記檢測 玉米》中的12對引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［26］。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

擴(kuò)增產(chǎn)物需在PCR儀上執(zhí)行變性程序：95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻10 min以上。采用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，點樣時同一引物的2個樣品相鄰，穩(wěn)壓穩(wěn)流狀態(tài)電泳后用全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相讀帶。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

采用GB/T 39914—2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標(biāo)記檢測 玉米》中的檢測方法。擴(kuò)增產(chǎn)物自帶染料，無須加入Lading Buffer。擴(kuò)增產(chǎn)物需在PCR儀上執(zhí)行變性程序：95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻10 min以上。采用4.5% PAGE進(jìn)行灌膠，點樣時同一引物的2個樣品相鄰，90 W電泳80 min后用銀染法顯帶并觀察結(jié)果。銀染法顯帶步驟：固定—漂洗—染色—漂洗—顯影—定影—漂洗。

固定，10%HAc，1次，3 min；漂洗，ddH2O，1次，<10 s； 染色，0.2%AgNO3，1次5 min；漂洗，雙蒸水，1次，<10 s；

顯影，30 g NaOH+5 mL HCHO定容至1 000 mL ddH2O中，搖床上輕輕晃動至紋帶出現(xiàn)；定影，10%HAc定影，5 min；漂洗，ddH2O，1次，&lt;10 s。

1.2.5 毛細(xì)管電泳檢測。

將樣品在PCR儀上95 ℃變性5 min取出，冷卻10 min以上。用Qsep400熒光毛細(xì)管電泳設(shè)備進(jìn)行電泳檢測。電泳步驟：聯(lián)機(jī)與通氣檢查—放入緩沖液和Marker—放入樣品并復(fù)位—置入卡夾—卡夾鎖定與校準(zhǔn)—程序設(shè)定，程序設(shè)定好后點擊Run，開始電泳分離，可點擊Real time實時監(jiān)測電泳過程。結(jié)果用Q-Analyzer for Qsep400軟件進(jìn)行分析。

1.3 試驗設(shè)計

采用53、60 ℃ 2個退火溫度；2種不同來源的Taq DNA聚合酶；2臺不同企業(yè)不同年度購買的PCR擴(kuò)增儀；3種不同的電泳方法。為便于圖片標(biāo)記和數(shù)據(jù)處理，分別對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行編號（表2），并根據(jù)表3的試驗條件進(jìn)行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板質(zhì)量檢測

用植物基因組DNA提取試劑盒（Aidlab）提取的DNA模板，采用微量紫外分光光度計（TP-L-1000）進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示（表4），所提取的DNA模板質(zhì)量較高，能夠滿足試驗處理的質(zhì)量要求。每個樣品稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳下不同處理對PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響

采用瓊脂糖凝膠電泳的方法分析了擴(kuò)增程序中不同退火溫度、不同PCR擴(kuò)增儀和不同Taq DNA聚合酶對玉米品種真實性SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響。對比PCR產(chǎn)物電泳譜帶的清晰度和干凈度可知，53 ℃退火溫度條件下，電泳譜帶拖帶明顯，特異性較低，非特異性產(chǎn)物較多，雜質(zhì)多；60 ℃退火溫度條件下，條帶特異性高，雜質(zhì)少，條帶和背景較53 ℃退火溫度圖譜清晰、干凈。利用novoprotein（E1）和天根（E2）Taq DNA聚合酶得到的PCR產(chǎn)物電泳條帶特異性均較高，目標(biāo)條帶比較清晰、雜質(zhì)少、背景較干凈。但天根Taq DNA聚合酶未能擴(kuò)增出IbA甲、IIbA甲、IbB甲、IIbB甲中P25目的條帶。使用TP-96A（F）和BIO-RAD PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，對比條帶特性、背景清晰度可知，不同品牌儀器對結(jié)果的影響并不明顯（圖1）。因此，采用瓊脂糖凝膠電泳方法，得到結(jié)果為60 ℃退火溫度和novoprotein Taq DNA聚合酶較有利于開展玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳下不同處理對PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響

利用8個試驗處理分析了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳下不同退火溫度、不同Taq DNA聚合酶和不同品牌的PCR擴(kuò)增儀對玉米品種真實性SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響（圖2）。處理IaA乙與IIaA乙、IaB乙與IIaB乙比較，2個不同的退火溫度對目的條帶的特異性并無較大區(qū)別，雜質(zhì)少，條帶和背景均較干凈；處理IbA乙與IIbA乙、IbB乙與IIbB乙相比較，60 ℃圖譜雜質(zhì)少，背景干凈，條帶清晰易讀取。Taq DNA聚合酶E1和E2以及不同品牌的PCR擴(kuò)增儀對目的片段的擴(kuò)增結(jié)果并無較大區(qū)別，但E2未能擴(kuò)增出IbA乙、IIbA乙、IbB乙、IIbB乙中P25目的條帶，這與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相一致。因此，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳下60 ℃退火溫度和Taq DNA聚合酶E1較有利于玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測。

2.4 毛細(xì)管電泳下不同處理對PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響

不同退火溫度、Taq DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增儀下毛細(xì)管電泳圖譜與瓊脂糖凝膠電泳和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜相一致。通過膠圖（圖3）和信號圖（圖4）可知，2臺PCR擴(kuò)增儀對玉米品種真實性SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響無明顯區(qū)別。不同退火溫度處理下，53 ℃退火溫度的4個組合中，IaB丙、IbB丙非特異性條帶濃度比目的條帶高，IbA丙的非特異性條帶的信號明顯強(qiáng)于目的條帶；60 ℃退火溫度的膠圖背景干凈，雜質(zhì)少，特異性較高，信號圖中的主峰明顯，僅IIbA丙和IIbB丙中存在較多小于100 bp的非特異性條帶。Taq DNA聚合酶E1擴(kuò)增結(jié)果中，IaA丙、IIaA丙、IaB丙、IIaB丙非特異性條帶較少，背景較干凈；E2擴(kuò)增結(jié)果中，IbA丙、IIbA丙、IbB丙、IIbB丙小于100 bp和大于400 bp的非特異性條帶較多（圖5），部分條帶濃度高于目的條帶濃度，這可能與試驗條件組合不同有關(guān)。因此，在毛細(xì)管電泳下60 ℃退火溫度和Taq DNA聚合酶E1較有利于玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測，這與瓊脂糖凝膠電泳和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果相一致。

3 結(jié)論與討論

PCR擴(kuò)增是品種真實性分子標(biāo)記鑒定過程中的重要環(huán)節(jié)。影響PCR反應(yīng)結(jié)果的重要因素包括反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序和儀器設(shè)備等。該研究主要針對這3個方面進(jìn)行組合比較，得出最優(yōu)組合，以滿足分子檢測工作的開展需要，能夠快速為種子管理部門、執(zhí)法機(jī)關(guān)提供技術(shù)支撐。結(jié)果表明，60 ℃ 退火溫度有利于玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測；novoprotein Taq聚合酶較適合玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測；2種不同公司、不同年度采購的PCR擴(kuò)增儀對玉米品種真實性SSR標(biāo)記的檢測并無明顯區(qū)別。最終得出IIaA丙組合為最佳。

瓊脂糖凝膠電泳和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果中，E2未能擴(kuò)增出P25目的條帶；毛細(xì)管電泳檢測時，E2和PCR1組合，無論退火溫度是53 ℃還是60 ℃，均有目的條帶的主峰圖存在；E2和PCR2進(jìn)行組合時，均無目的條帶，這有可能由于某些引物與使用不同的PCR擴(kuò)增儀有關(guān)，也有可能與

人為操作有關(guān)。鑒于只使用GB/T39914—2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標(biāo)記檢測 玉米》中的12對引物，對其他引物擴(kuò)增效果尚不清楚，建議優(yōu)先使用E1，即novoprotein Taq DNA聚合酶。

3種方法檢測的片段大小基本一致，瓊脂糖凝膠電泳方法可擴(kuò)增出目的條帶的大概位置，分離效率較低，適宜鑒定2個品種是否為同一品種的檢測；變性PAGE銀染檢測法的儀器設(shè)備及試劑成本低廉，適合于少量材料的檢驗分析，特別是SSR標(biāo)記的篩選，其過程復(fù)雜，因素較多，且工作效率較低。毛細(xì)管電泳熒光檢測法具備高通量、上樣靈活、高靈敏度（1 pg/μL）和高分辨率（最佳可達(dá)1～4 bp）等優(yōu)勢，操作過程無須人工制膠、染色、加樣、拍照，操作簡便，可自動計算片段大小，結(jié)果美觀易判斷，可替代PAGE凝膠電泳，作為四川大批量材料的檢測分析，也為四川SSR指紋庫的構(gòu)建［27-29］打下堅實基礎(chǔ)。

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基金項目 南充市科技計劃項目（21YFZJ0019）。

作者簡介 林顯鳳（1989—），女，吉林前郭爾羅斯人，農(nóng)藝師，碩士，從事種子質(zhì)量監(jiān)督與檢驗研究。

*通信作者，助理研究員，碩士，從事花生遺傳育種研究。

收稿日期 2022-05-20