ABA在小麥幼胚培養(yǎng)中的應(yīng)用研究

摘要 為提高小麥幼胚體細(xì)胞再生頻率，以豫麥49、豫麥18、蘭考906為試驗(yàn)材料，研究不同濃度ABA對(duì)小麥幼胚離體培養(yǎng)特性和草酸鹽氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，不同基因型間、ABA濃度間小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率和草酸鹽氧化酶活性差異均達(dá)到極顯著水平，基因型間以豫麥18最高，蘭考906最低；不同ABA濃度間以0.10 mg/ L 處理對(duì)幼胚愈傷組織形成和分化最為有利；不同濃度ABA條件下小麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與草酸鹽氧化酶活性存在極顯著相關(guān)。

關(guān)鍵詞 小麥；幼胚；ABA；胚性愈傷組織；培養(yǎng)特性；草酸鹽氧化酶

中圖分類號(hào) S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）06-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.006

Application of ABA in Immature Embryo Culture of Wheat

HE Sheng－lian

（Wheat Research Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract In order to improve the regeneration frequency of somatic cells of wheat immature embryo，the effects of different ABA concentrations on tissue culture of immature embryo callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were studied with Yumai 49，Yumai 18 and Lankao 906 as the research materials.Results showed that the differences of induction frequency of emryogenic callus and differentiation rates of callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were extremely significant different between different ABA concentrations or genotypes，which were the highest in Yumai 18 and the lowest in Lankao 906 among different genotypes.Treatment with 0.10 mg/L between different ABA concentrations was most beneficial for immature embryogenic callus formation and differentiation.Induction frequency and oxalate oxidase activities of immature emryogenic callus of wheat? was extremely significant between different ABA concentrations.

Key words Wheat;Immature embryo;ABA;Embryonic calli;Cultural characters;Oxalate oxidase

在小麥的各種外植體中，幼胚是再生植株最有效的外植體［1-7］，小麥幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生體系具有多方面的應(yīng)用價(jià)值。但是，這一體系的建立受到諸多因素的影響，如外源植物激素［6-11］、供體的基因型［6-7，9，11］、幼胚的發(fā)育成熟程度（胚齡）［12-16］及其他環(huán)境條件等［17-18］。

脫落酸在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用最早主要集中在雙子葉植物及模式植物胡蘿卜的體胚發(fā)生研究上。早期的研究認(rèn)為，適當(dāng)濃度的脫落酸可抑制不正常胚狀體的形成，防止胚狀體過早萌發(fā)［19］。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，在胡蘿卜離體培養(yǎng)中使用0.1 μmol/L的脫落酸，胡蘿卜胚狀體有些不正常［20］。脫落酸在禾本科植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)中也有應(yīng)用，張棟等［21-23］研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度ABA對(duì)愈傷組織分化有利。于曉紅等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在小麥幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，脫落酸對(duì)晚期幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中加入適量的脫落酸有助于胚性愈傷組織的形成。

在組織培養(yǎng)過程中，草酸鹽氧化酶通過催化產(chǎn)生過氧化氫促進(jìn)細(xì)胞壁纖維素組成成分的交聯(lián)，加強(qiáng)初生細(xì)胞壁，限制細(xì)胞壁的膨脹，使細(xì)胞保持在一種致密的、非液泡狀態(tài)下， 從而促進(jìn)胚性愈傷組織的形成［24］。Caliskan等［24-27］研究表明，小麥和燕麥種子萌發(fā)過程中，草酸鹽氧化酶催化所產(chǎn)生的過氧化氫參與了細(xì)胞壁纖維素組成成分的交聯(lián)，草酸鹽氧化酶通過參與細(xì)胞壁的重新構(gòu)建，控制著細(xì)胞的生長發(fā)育進(jìn)程。由此可見，草酸鹽氧化酶是胚性愈傷組織形成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。鑒于此，筆者以冬小麥品種豫麥49 、豫麥18和蘭考906為試驗(yàn)材料，通過研究不同濃度ABA 對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)特性和草酸鹽氧化酶活性及其之間的關(guān)系，探討小麥幼胚高效再生體系建立的生理機(jī)制，以期為組織培養(yǎng)技術(shù)在小麥改良中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料選用冬小麥品種豫麥18、豫麥49、蘭考906。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基（MS+ Gln 250 mg/L+蔗糖60 g/L+瓊脂8 g/L，pH= 5.8）。

繼代培養(yǎng)基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中加入ABA（0、0.05、0.10、0.50 mg/L）。分化培養(yǎng)基：1/2 MS+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+蔗糖60 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。誘導(dǎo)及繼代條件為25 ℃、無光照。分化條件為25? ℃ 、光照16 h/d、光照度2 500 lx。

1.2.2 幼胚的選擇及培養(yǎng)。

開花期選擇生長一致的麥穗掛牌標(biāo)記，于開花后13～14 d取標(biāo)記麥穗帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冷藏保存待用，接種時(shí)剝出中部小穗下部第1、2位小花籽粒，經(jīng)75%酒精消毒30 s和0.1%升汞消毒10～15 min，無菌水洗3～5次。在無菌條件下將幼胚剝出，盾片向上接在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后的初始愈傷組織，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)14 d后，一部分先后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基，再誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，并于14 d后統(tǒng)計(jì)分化率；同時(shí)取另一部分胚性愈傷組織在液氮中處理30 s，然后保存于- 80? ℃冰箱，以備測(cè)定草酸鹽氧化酶活性。

1.2.3 草酸鹽氧化酶活性的測(cè)定。草酸鹽氧化酶活性的測(cè)定方法參照Lane等［24］方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 誘導(dǎo)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基之前，進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)，分化培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)分化率。

胚性愈傷誘導(dǎo)率（%）=（胚性愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)）×100。

分化率（%）=（分化的愈傷組織塊數(shù)/接種在分化培養(yǎng)基上的愈傷組織塊數(shù)）× 100。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率和草酸鹽氧化酶活性采用Excel和SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同ABA對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)特性的影響

通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度ABA，分析其對(duì)幼胚組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，不同基因型間、ABA 濃度間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率差異均達(dá)極顯著水平。由此可見，ABA在幼胚離體培養(yǎng)中有重要的調(diào)控作用，同時(shí)品種間效應(yīng)也存在顯著差異。

2.2 不同基因型對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)特性的影響

由表1可知，在試驗(yàn)條件下，基因型間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均達(dá)到極顯著差異。誘導(dǎo)率以豫麥18最高，為74.2%；豫麥49次之，蘭考906最低，豫麥18胚性誘導(dǎo)率分別是豫麥49和蘭考906的1.24、1.41倍。分化率以豫麥18最高（72.1%），分別是豫麥49和蘭考906的1.25和1.44倍；豫麥49次之（57.9%），蘭考906最低。

2.3 ABA 濃度對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)特性的影響

對(duì)不同濃度ABA誘導(dǎo)下幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率進(jìn)行分析（表2），結(jié)果顯示在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)隨ABA濃度的增加，3個(gè)品種胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率增加，之后由于濃度過高又下降，其中0.10? mg/L ABA胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均較大。與不加ABA處理相比，0.05? mg/L濃度ABA處理均極顯著增加豫麥18胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，而對(duì)豫麥49和蘭考906增加效應(yīng)不顯著；0.10和0.50 mg/L ABA處理均顯著增加3個(gè)品種胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，且差異均達(dá)到極顯著水平，其中0.50較0.10? mg/L濃度的ABA效應(yīng)降低，但差異不顯著。從表2還可以看出，各濃度ABA培養(yǎng)下胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率排序均為豫麥18>豫麥49>蘭考906。

2.4 ABA濃度對(duì)草酸鹽氧化酶活性的影響 從表3可以看出，ABA濃度對(duì)不同基因型幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性均有顯著影響，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，隨培養(yǎng)基中附加ABA濃度的提高，草酸鹽氧化酶活性先提高，當(dāng)達(dá)到一定濃度之后又下降。

從表3還可以看出，當(dāng)附加0.10 mg/L ABA時(shí)，3個(gè)基因型幼胚胚性愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性均較高，且與其他濃度處理間均達(dá)極顯著差異；沒有附加ABA處理的草酸鹽氧化酶活性最低，且與其他濃度處理間差異均達(dá)顯著水平。豫麥49 附加0.05 mg/L ABA處理的草酸鹽氧化酶活性小于附加0.50 mg/L ABA處理，而豫麥18和蘭考906附加0.05? mg/L ABA處理大于附加0.50 mg/L ABA處理的草酸鹽氧化酶活性。

相關(guān)分析表明，不同ABA濃度處理的草酸鹽氧化酶活性與幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率間相關(guān)系數(shù)為0.961，相關(guān)性達(dá)極顯著水平。

3 結(jié)論與討論

于曉紅等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ABA對(duì)幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，加入適量的脫落酸有助于胚性愈傷組織的形成。該試驗(yàn)以適齡的幼胚為試驗(yàn)材料進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果表明0.10 mg/L ABA能改進(jìn)愈傷組織的生長狀態(tài)，獲得較多質(zhì)量高、致密的愈傷組織，有助于胚性愈傷組織的形成，從而提高分化率。當(dāng)ABA濃度進(jìn)一步提高時(shí)，愈傷組織質(zhì)量反而有不同程度下降。關(guān)于ABA調(diào)節(jié)小麥幼胚愈傷組織培養(yǎng)特性的機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

有關(guān)小麥組織培養(yǎng)過程中草酸鹽氧化酶活性及其調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。該研究結(jié)果表明，小麥幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性受外源物質(zhì)和基因型的影響，不同濃度ABA 對(duì)幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性有顯著影響，并且隨外源物質(zhì)濃度的增加而增加，但濃度過量時(shí)反而會(huì)降低，以0.10 mg/L 濃度處理幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性最高，且品種間的效應(yīng)也存在顯著差異。小麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與草酸鹽氧化酶活性之間分析表明，二者之間極顯著相關(guān)。Caliskan等［24-28］研究表明，草酸鹽氧化酶是胚性愈傷組織形成過程中的關(guān)鍵酶。因此，加強(qiáng)組織培養(yǎng)過程草酸鹽氧化酶的研究，通過外源物質(zhì)的調(diào)控、基因型的選擇等因素促進(jìn)幼胚形成愈傷組織過程中草酸鹽氧化酶基因的表達(dá)，將從生理機(jī)制上提高小麥幼胚體細(xì)胞再生的研究，促進(jìn)組織培養(yǎng)技術(shù)在品種改良中的應(yīng)用。

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基金項(xiàng)目 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)性科研工作項(xiàng)目（2022JC01，2023JC01）;河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目（2022ZC02）。

作者簡介 何盛蓮（ 1972—），女，河南商城人，研究員，碩士，從事小麥遺傳育種研究。

收稿日期 2022-05-05