炎癥相關(guān)因子TLR4 NF-κB在特發(fā)性膜性腎病腎組織中的表達(dá)及臨床意義

劉程君, 潘 艷, 劉 磊, 陳衛(wèi)東, 陳 暢, 常保超

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科, 安徽 蚌埠 233000)

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是腎病綜合征常見的病理類型,也是導(dǎo)致腎衰竭的主要原因。近年來,IMN的發(fā)病率顯著上升,逐漸成為成人常見的原發(fā)性腎小球疾病之一。其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫介導(dǎo)和炎癥損傷在其發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用,而且越來越多的研究顯示多種炎癥因子和免疫反應(yīng)相互作用共同參與了腎病的發(fā)病機(jī)制,與腎臟疾病進(jìn)展有著密切關(guān)系。炎癥反應(yīng)的發(fā)生涉及多種信號(hào)通路,其中核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)途徑是人類腎臟疾病中重要激活靶點(diǎn),多種致病因素激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而激活下游通路NF-κB途徑,引起腎小球免疫炎癥反應(yīng)[1]。既往已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,TLR4、NF-κB在膜性腎病大鼠中高表達(dá),通過抑制TLR4/NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以減輕腎臟損傷,我們有理由相信炎癥因子TLR4、NF-κB在IMN患者腎臟組織病變過程中發(fā)揮同樣重要作用[2]。因此,本研究選取IMN患者進(jìn)行腎組織炎癥因子TLR4、NF-κB水平表達(dá),觀察炎癥在IMN中的表達(dá),為IMN的發(fā)病機(jī)制及治療方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組:研究對(duì)象選取2021年3月至2022年3月于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢初次診斷為特發(fā)性膜性腎病的患者45例為特發(fā)性膜性腎病組(IMN組),平均年齡(50.40±7.77)歲,其中男性30例,女性15例。同期選取因腎挫傷、腎腫瘤或輸尿管腫瘤等行腎臟切除留取健康腎臟組織20例作為正常對(duì)照組(NC組),平均年齡(56.80±7.32)歲,其中男性12例,女性8例。同時(shí)根據(jù)病理結(jié)果Masson染色觀察腎小管-間質(zhì)是否伴有纖維化,將IMN組分為IMN纖維化組29例,平均年齡(53.24±6.69),IMN無纖維化組16例(45.25±7.04)。主要納入標(biāo)準(zhǔn):所有研究對(duì)象年齡均大于18歲,均排除近期合并感染、嚴(yán)重心臟疾病、肝臟疾病等,且未接受過糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療;IMN組的患者需經(jīng)我院腎活檢初次診斷為IMN,排除因腫瘤、糖尿病、高血壓、藥物、肥胖、自身免疫性疾病等其他繼發(fā)性膜性腎病的可能;對(duì)照組選取的腎組織經(jīng)我院病理科證實(shí)為無腫瘤轉(zhuǎn)移的正常腎組織。此研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):[2020]第117號(hào))。

1.2一般臨床資料及生化指標(biāo):收集所有研究對(duì)象的一般臨床資料,包括姓名、性別、年齡、住院號(hào)、病程及聯(lián)系方式等。所有受試者的生化指標(biāo)均來自在我院行空腹抽取外周靜脈血所得,包括血清白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、高密度脂蛋白(HDL)等,并化驗(yàn)24h尿蛋白定量(24h-Upro)。

1.3病理組織:IMN組患者的病理組織蠟塊從合肥金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司獲取,將由我院泌尿外科獲取的NC組腎組織制作成病理組織蠟塊,分別將包埋在蠟塊中的腎組織標(biāo)本取3μm厚度切片。

1.4主要試劑:兔抗P-NF-kB p65多克隆抗體(貨號(hào)GB113882,稀釋比例為1∶300),兔抗TLR4多克隆抗體(貨號(hào)GB11519,稀釋比例為:1∶300)。上述抗體均購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.5組織染色:將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、75%酒精5min,流水反復(fù)沖洗幾遍,脫蠟至水。分別進(jìn)行HE、Masson染色,光鏡下觀察各組腎臟組織病理變化。

1.6免疫組化染色:將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、二甲苯Ⅲ20min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、85%酒精5min、75%酒精5min,流水反復(fù)沖洗幾遍,脫蠟至水后,置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(PH6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,然后于室溫下進(jìn)行血清封閉30min,依次在PBS中滴加按一定比例配好的一抗、二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,脫水封片,顯微鏡鏡檢,最后進(jìn)行圖像采集分析。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色,DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。腎組織免疫組化中棕黃色染色為炎癥因子陽性表達(dá),棕黃色著色越深,炎癥因子表達(dá)越高。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野,用Image J圖像分析軟件測(cè)得每個(gè)視野的平均光密度值,并以其10個(gè)視野的平均光密度值的均值反映炎癥因子陽性表達(dá)的強(qiáng)度,均值越大,陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1IMN組與NC組病理組織學(xué)檢查:在光鏡下HE染色及Masson染色顯示,IMN組患者腎組織具有腎小球形態(tài)不規(guī)則彌漫性病變,毛細(xì)血管袢基底膜上皮下嗜復(fù)紅物沉積,系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒樣變性,腎間質(zhì)水腫伴有炎性細(xì)胞浸潤等特征。結(jié)果見圖1。

圖1 兩組腎組織病理染色結(jié)果(×400)注:圖A、圖B分別為特發(fā)性膜性腎病組腎組織行HE染色、Masson染色的顯微鏡下圖片;圖C、圖D分別為正常對(duì)照組腎組織行HE染色、Masson染色的顯微鏡下圖片

2.2IMN組及NC組腎組織炎癥因子的表達(dá):腎組織免疫組化中棕黃色為炎癥因子的陽性表達(dá),顯微鏡下顯示IMN組與NC組腎組織中有不同程度的炎癥表達(dá),IMN組中的腎小管及腎小球細(xì)胞中存在的炎癥因子TLR4、NF-κB的陽性表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。利用Image J圖像分析軟件測(cè)得10個(gè)視野的平均光密度值,并取其均值進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示IMN組腎組織的炎癥因子TLR4(t=10.83,P<0.01)、NF-κB(t=9.80,P<0.01)表達(dá)圖像的平均光密度值顯著升高,炎癥表達(dá)明顯增強(qiáng),與NC組比較明顯差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IMN纖維化組TLR4、NF-κB的陽性表達(dá)的平均光密度值明顯高于無纖維化組(t=2.09,P<0.05)、(t=3.15,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見表1、圖2及圖3。

表1 各組腎組織中TLR4 NF-κB平均光密度值比較

圖2 兩組TLR4、NF-κB的表達(dá)水平

圖3 三組腎組織免疫組化染色結(jié)果注:圖a、b分別為IMN纖維化組,圖c、d分別為IMN無纖維化組,圖e、f分別為NC組等腎組織切片行免疫組化檢測(cè)TLR4、NF-κB在顯微鏡下所采集的圖片

2.3腎組織炎癥相關(guān)因子的表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析:相關(guān)分析結(jié)果提示,TLR4表達(dá)水平與血清白蛋白(r=-0.544,P<0.01)、高密度脂蛋白(r=-0.463,P<0.01)呈負(fù)相關(guān),與24h尿蛋白定量(r=0.308,P<0.05)、血清膽固醇(r=0.485,P<0.01)、低密度脂蛋白(r=0.433,P<0.01)呈正相關(guān)。NF-κB表達(dá)水平與血清白蛋白(r=-0.307,P<0.05)、高密度脂蛋白(r=-0.334,P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與24h尿蛋白定量(r=0.319,P<0.05)呈正相關(guān)。TLR4、NF-κB表達(dá)水平與血清肌酐、尿酸、尿素氮均無相關(guān)性(P>0.05)。詳見表2。

表2 TLR4 NF-κB平均光密度值與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4TLR4、NF-κB相關(guān)性分析:相關(guān)分析結(jié)果示,腎組織中TLR4的表達(dá)與NF-κB的表達(dá)兩者之間呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.476,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 TLR4 NF-κB的相關(guān)性分析

3 討 論

近些年來,越來越多的研究顯示炎癥因素在IMN的發(fā)病過程中起到重要作用。炎癥是疾病發(fā)展過程中的重要病理反應(yīng),它可以發(fā)生在各種類型的疾病中,各種炎癥因子之間相互作用介導(dǎo)的腎損傷而產(chǎn)生的蛋白尿是膜性腎病發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán),在慢性腎臟病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[3]。因此,分析炎癥因子在IMN表達(dá)顯得極為重要。

Toll樣受體是先天性免疫受體,會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)源性危險(xiǎn)因素進(jìn)行反應(yīng),并促進(jìn)機(jī)體進(jìn)行免疫和炎癥反應(yīng),其中TLR4是腎臟炎癥的重要介質(zhì),主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞,同時(shí)作為信號(hào)通路的啟動(dòng)因子,激活腫瘤壞死因子、NF-κB等多個(gè)下游通路,進(jìn)而激活多種炎癥介質(zhì)的釋放引起腎臟纖維化,導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)及功能改變。已有研究報(bào)道,在膜性腎病患者的腎組織中,TLR4表達(dá)上調(diào),血管緊張素Ⅱ通過提高TLR4表達(dá)而促進(jìn)足細(xì)胞凋亡,引起腎損傷[4]。Mertowski[5]等研究顯示Toll樣受體作為腎臟疾病潛在的生物標(biāo)志物,TLR4的基因表達(dá)在對(duì)照組及IMN組患者中存在明顯差異,其與IMN發(fā)病過程密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法對(duì)IMN患者腎組織中TLR4水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IMN組TLR4表達(dá)水平上調(diào),而NC組TLR4低水平表達(dá),結(jié)果與既往研究相符。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步做了TLR4與臨床資料進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果顯示TLR4與血清白蛋白、高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān),與24h尿蛋白定量、血清膽固醇、低密度脂蛋白呈正相關(guān)。因此我們考慮可以通過多種途徑來干預(yù)TLR4的表達(dá),減輕腎臟炎癥反應(yīng),改善腎病患者臨床癥狀。蔡莉[6]等研究通過miR-25-3p靶向抑制TLR4轉(zhuǎn)錄和翻譯,進(jìn)而抑制促炎性因子的轉(zhuǎn)錄,改善糖尿病腎病炎癥反應(yīng)。也有研究報(bào)道,可以通過抑制TLR4/MyD88、TLR4/NF-κB等信號(hào)通路來干預(yù)TLR4的表達(dá),從而改善腎臟纖維化,延緩疾病進(jìn)展。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,炎癥因子TLR4與IMN密切相關(guān),參與了IMN的發(fā)病過程。

NF-κB廣泛存在于腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中,為炎癥反應(yīng)的下游信號(hào)通路,在細(xì)胞損傷和腎臟纖維化中起到重要作用[7]。多種外界因素刺激下,如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等,可導(dǎo)致細(xì)胞中NF-κB激活,促進(jìn)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子的釋放,對(duì)腎臟足細(xì)胞、系膜細(xì)胞造成炎性損傷,導(dǎo)致腎組織纖維化和蛋白尿等,嚴(yán)重者引起腎衰竭[8]。樊紅衛(wèi)[9]等研究指出NF-κB在膜性腎病大鼠中表達(dá)上調(diào),川芎嗪可以使NF-κB p65失活從而抑制炎癥反應(yīng),改善腎臟損傷。本研究結(jié)果顯示,NC組NF-κB低水平表達(dá),IMN組NF-κB表達(dá)水平上調(diào),炎癥表達(dá)明顯增強(qiáng)。同時(shí)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析提示NF-κB表達(dá)水平與血清白蛋白、高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān),與24h尿蛋白定量呈正相關(guān),這提示了NF-κB在IMN疾病發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。Chebotareva[10]等研究也發(fā)現(xiàn),在慢性腎小球腎炎患者中,NF-κB的表達(dá)水平與蛋白尿密切相關(guān),這與本實(shí)驗(yàn)研究相符,因此我們可以設(shè)想通過阻斷NF-κB信號(hào)通路的表達(dá),減少蛋白尿,保護(hù)腎功能。

此外本研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子TLR4、NF-κB在IMN腎組織中不僅表達(dá)水平升高,且相關(guān)性分析顯示兩者間呈正比,表明其在炎癥過程相互作用和相互影響,從而認(rèn)為機(jī)體可能通過激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而影響下游通路細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)腎組織纖維化,加重腎臟損傷,共同參與了IMN的發(fā)病。

綜上所述,IMN患者腎組織中炎癥因子TLR4、NF-κB表達(dá)水平明顯升高,且兩者間相互作用導(dǎo)致腎組織纖維化,引起腎臟損傷,說明TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在IMN的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用,為進(jìn)一步探索IMN發(fā)病機(jī)制提供依據(jù),也為IMN的診斷及治療提供新的視角。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,需加大樣本量得到更有利的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,同時(shí)完善外周血清中炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步探討信號(hào)通路在IMN中的表達(dá)。