HPV感染與ERK信號通路關(guān)鍵因子在宮頸癌中的交互效應(yīng)及臨床意義

張曉敏, 楊年紅

(湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院婦科, 湖北 恩施 445000)

全球每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例,中國每年新增13.15萬宮頸癌病例,約占全球總數(shù)1/3[1,2]。高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌及癌前病變重要因素,宮頸癌發(fā)病高峰集中于40歲,HPV感染發(fā)病高峰集中于20歲,從感染HPV發(fā)展為宮頸癌這種倒金字塔式流行病學(xué)分布說明還有更多其他因素參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展[3,4]。分子和細(xì)胞生物學(xué)方法揭示,ERK信號通路異?；罨梢种萍?xì)胞分化、凋亡功能,增強(qiáng)細(xì)胞異常增殖和侵襲能力,參與多種實(shí)體瘤(肝癌、乳腺癌、前列腺癌)發(fā)病過程[5]。ERK信號通路涉及核不均一核糖核蛋白E1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HnRNP E1)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(P-extracellular regulated kinase1/2,p-ERK1/2)、磷酸化非受體酪氨酸激酶(p-Src)等關(guān)鍵因子,目前有關(guān)ERK信號通路關(guān)鍵因子在宮頸癌中表達(dá)及其與HPV感染間關(guān)系研究甚少,本研究初步探究兩者在宮頸癌中交互效應(yīng),為探索宮頸癌鑒別診斷及靶向治療方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年10月至2022年10月我院收治的90例宮頸癌患者作為研究組,年齡20～60(45.05±3.33)歲;體質(zhì)量指數(shù)18～23(20.55±0.71)kg/m2;FIGO分期:49例ⅠB期,41例ⅡA期;腫瘤直徑1.0～4.0(2.56±0.41)cm;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:21例有,69例無;分化程度:60例中高分化,30例低分化;病理分型:18例腺癌,72例鱗癌。另納入90例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者作為對照組,年齡22～60(43.99±4.58)歲;體質(zhì)量指數(shù)19～23(20.64±0.58)kg/m2;病理類型:40例CIN Ⅰ～Ⅱ級,50例CIN Ⅲ級。兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)均衡可比(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn):研究組符合《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]:FIGO分期ⅠB期、ⅡA期,均未進(jìn)行放療、化療等相關(guān)生物學(xué)治療,病理活檢證實(shí)宮頸癌;對照組符合《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];均為女性;患者及家屬知曉并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):伴卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮腺肌癥等生殖系統(tǒng)疾病;重要臟器器質(zhì)性病變;哺乳期或妊娠期女性;凝血異常;伴有明確急慢性感染性疾病;其他惡性腫瘤(胃癌、肺癌、肝癌)。

1.2方 法

1.2.1HPV檢測:取膀胱截石位,充分顯露宮頸口,無菌棉球擦拭宮頸外口分泌物,將HPV取樣器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)插入宮頸內(nèi)口,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3周,停留10s左右,置于無菌取樣管,離心后得到沉淀細(xì)胞液,加入細(xì)胞裂解液,提取DNA,應(yīng)用艾吉康生物科技北京有限公司生產(chǎn)HPV試劑盒測定,涉及10種高危HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、58、52、51)。當(dāng)樣品HPV相對光單位表達(dá)值/陽性標(biāo)準(zhǔn)品閾值<1.0判定為陰性,≥1.0判定為陽性,并將陽性分為3個病毒負(fù)荷量級別(1～100、101～1000、>1000)。

1.2.2ERK信號通路關(guān)鍵因子檢測

1.2.2.1免疫組化染色:①磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)將所需抗體按比例稀釋,HnRNP E1為1∶100,p-ERK1/2、p-Src為1∶150;②經(jīng)病理活檢獲取子宮頸組織,石蠟包埋,連續(xù)切片(每片約4 μm),脫蠟水化,PBS沖洗3次;③將切片置于枸櫞酸鹽修復(fù)液,高壓鍋內(nèi)熱修復(fù),100 ℃ 3min,自然冷卻至室溫,PBS沖洗3次,3%過氧化氫(H2O2)封閉,室溫孵育10min,PBS沖洗3次;④甩去PBS液體,每張切片滴加50μL一抗,4℃過夜孵育;⑤PBS沖洗3次,滴加試劑1,37℃孵育20min,PBS沖洗3次,滴加試劑2,37℃孵育30min,PBS沖洗3次;⑥滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,室溫放置5min,自來水沖洗,行蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)、脫水、中性樹脂封片等操作,顯微鏡下觀察結(jié)果,拍照保存。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性對照、陰性對照及空白對照。

1.2.2.2結(jié)果判定:①定位:HnRNP E1、p-ERK1/2表達(dá)定位于細(xì)胞核,p-Src表達(dá)定位于細(xì)胞漿,出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性;②評分標(biāo)準(zhǔn):由兩名觀察者盲式閱片,陽性范圍含>50%(3分)、26%～50%(2分)、1～25%(1分)、0%(0分),染色程度含深棕色(3分)、棕色(2分)、淡棕色(1分)、不著色(0分),兩者相加即為總分,總分超過2分即為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS22.0軟件包處理數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料以n(%)表示,行χ2檢驗(yàn),Spearman分析相關(guān)性,Logistic回歸方程分析交互作用。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

研究組HPV感染率明顯高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),詳見表1;研究組HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白陽性率均高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),詳見表2;研究組不同F(xiàn)IGO分期、HPV感染、分化程度患者HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3;Spearman顯示,宮頸癌患者FIGO分期、HPV感染、分化程度與HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白呈正相關(guān)(P<0.05),詳見表4;HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白之間均呈正相關(guān),故可能存在多重共線性作用。以宮頸癌患者是否有HPV感染(是=1,否=0)為因變量,HnRNP E1蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-Src蛋白及三者交互作用交量為自變量,一般臨床病理特征為協(xié)變量,行二分類Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白及三者交互作用是宮頸癌患者HPV感染高危因素(P<0.05),詳見表5。

表1 比較研究組和對照組HPV感染情況n(%)

表2 比較研究組和對照組患者ERK信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)n(%)

表3 比較研究組不同臨床病理特征患者ERK信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)n(%)

表4 宮頸癌臨床病理特征與ERK信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)相關(guān)性(r/P)

表5 ERK信號通路關(guān)鍵因子對宮頸癌HPV感染的影響

3 討 論

2020年我國新發(fā)宮頸癌病例11萬,因?qū)m頸癌死亡病例約6萬,宮頸癌發(fā)病與HPV感染密切相關(guān),中國最常見5種高危HPV型別分別是16、18、58、52、33,其中HPV16感染率達(dá)46.5%～53.2%[8]。本研究發(fā)現(xiàn)研究組HPV感染率高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),與劉曉旭等[9]研究觀點(diǎn)相近。約1/3感染HPV 16亞型婦女在1年內(nèi)演變?yōu)镃IN,約15%CIN患者演變?yōu)閷m頸癌[10]。由此可見,僅少數(shù)感染HPV女性可發(fā)展為宮頸癌,說明仍存在其他協(xié)同致癌因素存在,明確HPV以外的其他致癌因素是宮頸癌重點(diǎn)研究方向。

ERK信號通路異?；罨c宮頸癌細(xì)胞增殖密切相關(guān),但多集中于綜述方面,鮮見臨床實(shí)驗(yàn)研究。國外學(xué)者提出,隨著正常宮頸組織向?qū)m頸癌發(fā)展,p-ERK1/2表達(dá)逐漸增強(qiáng),與本研究觀點(diǎn)相符[11]。ERK1/2是ERK家族重要成員,正常情況下位于胞質(zhì)內(nèi),激活后移位于細(xì)胞核,經(jīng)磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能,影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。推測原因其參與突變Ras基因所致宮頸癌Hela細(xì)胞增殖有關(guān),發(fā)揮抗凋亡效應(yīng),促進(jìn)癌細(xì)胞生長、分裂及向惡性轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn),研究組HnRNP E1蛋白陽性表達(dá)率高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級,說明HnRNP E1蛋白是子宮頸病變過程中早期事件。HnRNP E1含有3個高度保守KH結(jié)構(gòu)域,除具有HnRNPs共有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯功能外,還可參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程。陳霄[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn),HnRNP E1蛋白陽性率隨子宮頸癌變進(jìn)展而升高。但有學(xué)者持反對意見,認(rèn)為HnRNP E1蛋白陽性率隨子宮頸病變進(jìn)展而降低,推測與樣本量、種族差異等有關(guān)[13],有關(guān)HnRNP E1蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具體機(jī)制有待深入研究。Src屬非受體蛋白酪氨酸激酶,可被細(xì)胞膜表面G蛋白耦連受體、生長因子受體激活,激活多條信號通路,產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),在腫瘤研究中備受關(guān)注。已知研究表明,Src在宮頸癌組織及細(xì)胞系中活性增強(qiáng),推測與其促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞周期向G2/M期轉(zhuǎn)變,加快腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。本研究數(shù)據(jù)顯示,研究組p-Src蛋白陽性率為53.33%,明顯高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),說明p-Src蛋白在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變鑒別診斷中具有提示作用。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),抑制Src活性可有效抑制大鼠宮頸癌細(xì)胞增殖、生長,有望成為宮頸癌治療靶點(diǎn)之一[15]。

相關(guān)性顯示,宮頸癌HPV感染與HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白呈正相關(guān),且3種蛋白間均呈正相關(guān),說明可能存在多重共線性作用。經(jīng)Logistic回歸方程檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白及三者交互作用是宮頸癌患者HPV感染高危因素(P<0.05)。HPV E6/E7蛋白可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體來調(diào)控Src蛋白表達(dá),刺激ERK信號通路,誘導(dǎo)ERK1/2、HnRNP E1表達(dá),促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長和增殖。同時(shí)HnRNP E1作為特殊RNA結(jié)合蛋白,所含KH域可與許多病毒基因結(jié)合,如HPV E2/E3、E6/E7,協(xié)同作用下促進(jìn)宮頸癌病情進(jìn)展。因此,防控HPV感染或研發(fā)以ERK信號通路關(guān)鍵因子為干預(yù)靶點(diǎn)的藥物有望降低兩者形成交互效應(yīng)機(jī)會,降低宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),保障中國廣大女性身心健康。

綜上所述,HPV感染及ERK信號通路關(guān)鍵因子陽性表達(dá)均可增加宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),兩者存在正向交互作用,可為宮頸癌鑒別診治提供有利參考信息。