MAGE-As 蛋白及mRNA在肺癌患者的表達(dá)水平變化及其臨床意義

李艷勇, 趙雪強(qiáng), 陳家文, 楊 革, 肖智宏

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 廣西 桂林 541199)

肺癌是常見胸部惡性腫瘤,其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌,目前肺癌新發(fā)病例和新增死亡病例逐年升高,隨著現(xiàn)代治療手段的發(fā)展,肺癌診治取得了顯著的提高,但是肺癌患者5年生存率仍低于20%,近年來(lái)個(gè)體化藥物、生物標(biāo)記物逐漸在臨床引起重視,越來(lái)越多的研究朝向生物靶向治療[1]。黑色素瘤相關(guān)抗原是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)可以被細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別的少數(shù)腫瘤特異性抗原之一,其在肺癌中總表達(dá)率可以達(dá)到46%,但是目前臨床對(duì)于黑色素瘤相關(guān)抗原組織表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)的研究臨床報(bào)道說(shuō)法不一,尤其是在非小細(xì)胞肺癌中的研究相對(duì)少見[2]。本研究分析了黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-As蛋白及mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù),現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:2015年1月至2020年1月。我院治療的非小細(xì)胞肺癌患者88例,其中男性47例,女性41例;年齡<60歲患者43例,≥60歲患者45例;病理類型:腺癌33例,鱗癌55例;臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期50例,Ⅲ～Ⅳ期38例;分化程度:高分化23例,中低分化65例。同時(shí)選取88例癌旁組織(>5cm)作為對(duì)照,納入標(biāo)準(zhǔn):①均經(jīng)病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌;②術(shù)前無(wú)放化療等治療史;③臨床隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn):①?gòu)?fù)發(fā)或合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤;②有慢性阻塞性肺疾病等其他肺部疾病。

1.2實(shí)驗(yàn)方法:MAGE-As蛋白表達(dá)檢測(cè):取適量肺癌組織和癌旁組織置于勻漿器中,加入裂解液進(jìn)行裂解勻漿30min,提取蛋白,完成后取裂解液于4℃下12000rpm進(jìn)行離心,離心時(shí)間5min,完成后取上清液留取備用,并采用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析,留取剩余蛋白提取液備用;制備蛋白負(fù)載緩沖液,將上述蛋白質(zhì)樣本溶液加入凝膠孔中,進(jìn)行電泳分析值樣本分離完畢,采用半濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,孵化,漂洗后記錄各條帶的灰度值,本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算MAGE-As蛋白的相對(duì)含量。MAGE-As mRNA檢測(cè):從肺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中獲取樣本,使用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的TRIzol試劑,按照說(shuō)明書的指導(dǎo)進(jìn)行組織總RNA的提取。確保TU-1810S型紫外分光光度計(jì)已經(jīng)安裝好,并且儀器處于正常工作狀態(tài),根據(jù)儀器的操作手冊(cè)進(jìn)行儀器的預(yù)熱和校準(zhǔn),根據(jù)測(cè)定得到的吸光度值和已知的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的RNA濃度。準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,準(zhǔn)備PCR反應(yīng)混合液,包括cDNA樣品、引物、熒光探針、聚合酶和PCR反應(yīng)緩沖液等。將PCR反應(yīng)混合液加入PCR管或反應(yīng)管中,確保樣品充分混合。設(shè)置PCR擴(kuò)增儀的溫度程序,包括初始變性步驟(95℃ 5min)和循環(huán)擴(kuò)增步驟(95℃ 45s、65℃ 45s、72℃ 90s,共31個(gè)循環(huán))。在PCR擴(kuò)增儀中運(yùn)行PCR反應(yīng),同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的累積。瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳 PCR 產(chǎn)物根據(jù)提供的信息,使用2-ΔΔCt公式計(jì)算MAGE-AsmRNA的相對(duì)表達(dá)量。在第一輪PCR中,使用MAGE-1引物(F: 5'-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3'; R: 5'-GCCCTGACCAGAGTCATCAT-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度為993bp的MAGE-1基因片段,使用MAGE-1-1引物(F: 5'-ACTGGCCTTGGCTGCAAC-3'; R: 5'-CCCTGACGAGAGTCATCATG-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度為965bp的MAGE-1基因片段。在第二輪PCR中,使用MAGE-2引物(F: 5'-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3'; R: 5'-AGGCCCTGGCCTGGTG-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度為914bp的MAGE-2基因片段,使用MAGE-2-2引物(F: 5'-ACTGGCCTTGGCTGCAAC-3'; R: 5'-AGGCCCTGGGCTTGGTG-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度為893bp的MAGE-2基因片段。作為內(nèi)參,使用GAPDH引物(F: 5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'; R: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。

1.3隨訪方法:對(duì)患者住院信息、門診復(fù)查及電話進(jìn)行記錄,同時(shí)采取家訪、電話等多種方式對(duì)患者信息進(jìn)行跟蹤隨訪,獲取臨床資料。

2 結(jié) 果

2.1非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織MAGE-As蛋白及mRNA表達(dá)比較:非小細(xì)胞肺癌組織MAGE-As蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織MAGE-As蛋白及mRNA表達(dá)比較

2.2MAGE-As蛋白與患者臨床病理特征:臨床分期Ⅲ～Ⅳ期肺癌組織MAGE-As蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期肺癌組織(P<0.05);不同性別、年齡等肺癌組織MAGE-As蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 MAGE-As蛋白與患者臨床病理特征

2.3MAGE-As mRNA與患者臨床病理特征:臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化程度肺癌組織MAGE-As mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期和高分化肺癌組織(P<0.05);不同性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型肺癌組織MAGE-As mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 MAGE-As mRNA與患者臨床病理特征

2.4不同MAGE-As mRNA表達(dá)患者總生存期比較:MAGE-As mRNA高表達(dá)(≥0.728)患者中位總生存期為33個(gè)月,明顯短于MAGE-As mRNA低表達(dá)患者44個(gè)月,MAGE-As高表達(dá)和MAGE-As mRNA低表達(dá)患者生存率有差異(χ2=4.416,P=0.036<0.05),見圖1。

圖1 不同MAGE-As mRNA表達(dá)患者總生存期曲線圖

2.5不同MAGE-As 蛋白表達(dá)患者總生存期比較:MAGE-As蛋白高表達(dá)(≥0.343)和低表達(dá)(<0.343)患者中位總生存期分別為36個(gè)月和36個(gè)月,兩組生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.003,P=0.316>0.05),見圖2。

圖2 不同MAGE-As 蛋白表達(dá)患者總生存期曲線圖

3 討 論

肺癌已成為威脅國(guó)人生命安全的高發(fā)病率疾病,目前發(fā)病率和死亡率均位居男性群體首位,早期對(duì)肺癌進(jìn)行診斷并開展積極地治療對(duì)改善患者預(yù)后意義重大[3]。近年來(lái)腫瘤免疫學(xué)的飛速發(fā)展讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤形成既同惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)在遺傳背景相關(guān),同時(shí)與人體免疫功能密切相關(guān)[4]。以往臨床診斷肺癌常用手段包括病理檢查、影像掃描,但是部分患者早期癥狀不明顯,因此檢查缺乏特異性,尤其是對(duì)于微小病變檢出效果不佳[5]。隨著現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展特異性腫瘤標(biāo)記物在惡性腫瘤診斷中發(fā)揮了重要作用,細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤的發(fā)展具有重要影響,腫瘤發(fā)生與細(xì)胞凋亡紊亂有關(guān),這一過程中基因的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的突變,最終導(dǎo)致惡性腫瘤形成并不斷進(jìn)展[6]。

黑色素瘤相關(guān)抗原(Melanoma-associated antigens,MACE)是由成千上萬(wàn)、多種多樣的免疫球蛋白(Ig)分子所組成,且屬于MAGE家族[7]。 其中MAGE-A家族包括12個(gè)家族成員,包括喉鱗狀細(xì)胞癌、食管癌等。然而MACE-A家族在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)尚不清楚[8]。其中有較高表達(dá)的MACE-As可參與三陰性乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)。MACE-As在肺癌中的研究尚少。

本研究分析了黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-As蛋白及mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況,MAGE基因?yàn)榭删幋a并產(chǎn)生蛋白家族,可在睪丸組織等多種癌組織中表達(dá)異常。黑色素瘤相關(guān)抗原主要表達(dá)在各種腫瘤組織中,正常的組織中則僅在睪丸中表達(dá),是癌睪丸抗原,目前臨床對(duì)于黑色素瘤相關(guān)抗原蛋白生物學(xué)功能并未完全清楚,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其末端107氨基酸殘疾能夠部分與基因相關(guān)鋅指蛋白1有關(guān),可以增加體內(nèi)p53的水平導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。還有研究顯示黑色素瘤相關(guān)抗原蛋白具有造成腫瘤高侵襲性作用,參與早期腫瘤形成同時(shí)能夠調(diào)控細(xì)胞增殖與侵襲,表達(dá)可能同肺癌耐藥相關(guān),而且表達(dá)率越高在短時(shí)間內(nèi)更容易發(fā)生耐藥,提示了黑色素瘤相關(guān)抗原同腫瘤生長(zhǎng)關(guān)系密切[10]。本研究還對(duì)患者臨床病理情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組織MAGE-As蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組織,提示MAGE-As蛋白表達(dá)與腫瘤分期具有一定關(guān)系。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化程度組織MAGE-As mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期和高分化組織,提示MAGE-As mRNA表達(dá)與腫瘤分期和分化程度具有一定關(guān)系。MAGE基因表達(dá)和組蛋白乙?；癄顟B(tài)之間具有一定關(guān)聯(lián),組蛋白乙酰化可以利用甲基化CpG結(jié)合蛋白同甲基化DNA序列緊密結(jié)合,組蛋白去乙?；富钚缘玫教嵘?對(duì)MAGE表達(dá)調(diào)控造成影響[11,12]。

本研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌組織MAGE-As蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高,提示非小細(xì)胞肺癌患者存在MAGE-As蛋白及mRNA高表達(dá)狀態(tài)。MAGE-As蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá),其能促進(jìn)肺癌進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn),MAGE-As蛋白在肺癌細(xì)胞核中積累,抑制肺癌細(xì)胞凋亡,并使肺癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑敏感性降低,意味著MAGE-As蛋白是腫瘤促進(jìn)因子,MAGE-As由蛋白酶體加工以產(chǎn)生抑制凋亡的C末端片段,其最終降低p53活性,從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。隨著年齡增長(zhǎng),以及基因不穩(wěn)定因素的增加,DNA的低甲基化狀態(tài)可誘導(dǎo)該基因的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤易感性增加[14]。從而提示非小細(xì)胞肺癌患者存在MAGE-As蛋白及mRNA高表達(dá)狀態(tài)。本研究還分析了非小細(xì)胞肺癌組織MAGE-As蛋白及mRNA表達(dá)在患者中的情況,同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了同分期和分化程度具有一定的關(guān)系,為臨床開展早期診斷和評(píng)估肺癌患者分期、類型、轉(zhuǎn)移情況、分化程度奠定了一定的依據(jù),但因本研究納入樣本數(shù)量不多,以及隨訪時(shí)間短,因此還需要開展多中心、大樣本量、長(zhǎng)期隨訪深入研究。

綜上所述,MAGE-As蛋白及mRNA在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào),與病情嚴(yán)重程度有關(guān),同時(shí)MAGE-As mRNA高表達(dá)患者預(yù)后較差。