侵襲性垂體腺瘤中TNF-α IL-6及VEGF之間表達(dá)水平變化的相關(guān)性研究

劉思洋, 吳建龍, 梅 贊, 蘇 彬, 王學(xué)文 齊迎松, 李斌斌, 王婷婷, 張金利, 高繼剛

(1.河北省承德市中心醫(yī)院, 河北 承德 067000 2..承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院, 河北 承德 067000)

垂體腺瘤約占全顱內(nèi)腫瘤的15%,只比腦膜瘤與膠質(zhì)瘤發(fā)病率低一些,是顱內(nèi)腫瘤比較常見的類型之一[1]。垂體腺瘤有可能呈現(xiàn)有異常與無異常激素分泌,據(jù)此可劃分為非功能性垂體腺瘤與功能性垂體腺瘤,前者可表現(xiàn)為性功能低下、閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、肢端肥大等一系列內(nèi)分泌方面的癥狀,后者無明顯內(nèi)分泌增加的癥狀。垂體腺瘤大都不會(huì)對患者的生命造成威脅,屬于良性生物學(xué)行為表現(xiàn),但也有25%～55%呈侵襲性生長狀態(tài),對于這部分垂體腺瘤,我們稱之為侵襲性垂體腺瘤,(invasive pituitaryadenom IPA),IPA通過部分快速生長并侵入周邊組織而破壞下丘腦、鄰近硬膜、海綿竇等正常結(jié)構(gòu)[2]。目前,針對于侵襲性垂體腺瘤而言,采取手術(shù)切除方法會(huì)起到良好療效,主要方法為經(jīng)鼻蝶竇顯微鏡、內(nèi)鏡手術(shù)。由于該疾病具有侵襲性生長的特點(diǎn),所以采取手術(shù)切除腫瘤很容易留下病灶,這導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率,患者預(yù)后不理想[3]。此外,考慮到侵襲性垂體腺瘤獨(dú)特的生長特點(diǎn),手術(shù)過程中組織可能殘留,徹底切除不易,復(fù)發(fā)率高,加上放療效果也不太理想。近年來,許多學(xué)者將IPA治療的研究重點(diǎn)放在藥物開發(fā)上,副作用少、具有高藥效、特異性較強(qiáng)的靶向藥物就是其中之一,未來可能實(shí)現(xiàn)[4]。查閱相關(guān)文獻(xiàn),TNF-α、對IL-6和VEGF在侵襲性垂體瘤中的研究也很多,為了能夠?yàn)镮PA的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ),重點(diǎn)研究了這三種因子在IPA中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源及處理:標(biāo)本來源于2016年10月至2020年6月的垂體腺瘤標(biāo)本,均由承德市中心醫(yī)院神經(jīng)外科醫(yī)師在手術(shù)切除時(shí)所取得,所有患者內(nèi)分泌檢查基本正常,臨床癥狀均未表現(xiàn)出各激素升高引起的表現(xiàn),部分患者有頭暈、頭痛癥狀,經(jīng)過系統(tǒng)的病理學(xué)檢查,最終判定這些標(biāo)本不屬于無功能性垂體腺瘤,Wilson-Hardy分為3～4級,術(shù)前顱MRI及術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤位于鞍底周圍、海綿竇等部位為侵襲性垂體腺瘤。在該標(biāo)準(zhǔn)中,分為無功能IPA 38例、非IPA 18例。標(biāo)本取材后立即置于-80℃液氮罐內(nèi)冷凍保存,其余標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑:一抗:TNF-α抗體、IL-6抗體、VEGF抗體(均為小鼠抗人多克隆抗體),抗體由美國Santa Crua生物技術(shù)公司生產(chǎn),二抗:酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物,美國Roche公司生產(chǎn),顯色系為DAB顯色系。TRIzol試劑盒由賽默飛生物技術(shù)公司生產(chǎn),采購大連寶生物公司熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒。

1.3免疫組織化學(xué)方法:IPA和非IPA組織取材(厚2mm),標(biāo)本取材后經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯等處理后,進(jìn)行石蠟包埋,然后切片(厚3～4μm),干燥溫度60℃以下,持續(xù)1h,脫蠟76℃ 16min,修復(fù)100℃ 64min,一抗(1∶100的小鼠抗TNF-α、IL-6和VEGF抗體)在37℃孵育24min,蘇體素在37℃孵育8min,藍(lán)色在37℃恢復(fù)4min。陰性對照與陽性對照分別由PBS與陽性切片代替,細(xì)胞漿以棕色黃色為陽性。采用免疫組化半定量方法綜合判定陽性和陰性:借助顯微鏡觀察切片,觀察范圍集中于腫瘤細(xì)胞密集區(qū),采取隨機(jī)挑選方法選擇5個(gè)視野,結(jié)合陽性強(qiáng)度與陽性細(xì)胞術(shù)做強(qiáng)度評價(jià)表達(dá):①0分:陽性細(xì)胞數(shù)不超過10%;1分:陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%;2分:陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%為2分;3分:陽性細(xì)胞數(shù)超過50%。②針對染色強(qiáng)度進(jìn)行評分的標(biāo)準(zhǔn)為:零分代表無著色、一分代表淺棕黃色著色、兩分代表棕黃色著色、三分代表深棕黃色角色。判定結(jié)果需要將①與②進(jìn)行綜合評定,陰性(-):0分、低表達(dá)(+):1～2分、中度表達(dá)(2+):3～4分、5～6分為高表達(dá)(3+)。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法:根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取組織中總RNA,倒轉(zhuǎn)復(fù)制成cDNA,進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。反應(yīng)體系合計(jì)20μL:TaqDNA聚合酶10μL、上下游引物各0.75μL,cDNA模板1.5μL,ddH2O 7μL。反應(yīng)條件:預(yù)改性95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃30s延長,共40個(gè)循環(huán)。試劑盒可以選擇熒光定量PCR,檢查對象為內(nèi)參基因與目的基因,TNF-α的正向引物序列為5-AAGCTCTGAGCCATTTGTAGGA-3′,反向引物序列為5′-GGGCAGACTTGCCCTTGAA-3′;VGEF正向引物序列為5’-AtGACTTTCTTGGATACA-3’,反向引物序列為5’-TACTCAGGATTTTCTTGT-3’;IL-6正向引物序列是5′-GGCCCTAAACAAGTCTA-3′,反向引物序列是5′-ATATATATCCATCCAGACGAAGCA-3′;β-actin的正向引物序列5’-TAGAGAGTCACTACTCGGCAAT-3’、反向引物序列5’-AAAGAAAGGATAACGCA-3’。測定各組基因相對表達(dá)量的方法為2-ΔΔCT法。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果:TNF-α試驗(yàn)組陽性表達(dá)率為66%(25/38),對照組為22%(4/18),兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.352,P=0.007);IL-6在試驗(yàn)組的陽性表達(dá)率為71%(27/38),對照組為28%(5/18),兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.090,P=0.008);試驗(yàn)組VEGF陽性表達(dá)率為61%(23/40),對照組為17%(3/18),兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.789,P=0.005)。見圖1、表1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測TNF-α、IL-6及VEGF在IPA及NIPA中的表達(dá)(SPX200)①③⑤為三者在IPA中的表達(dá)呈陽性,②④⑥在NIPA中的表達(dá)呈陰性,其中①②為TNF-α,③④為IL-6,⑤⑥為VEGF

表1 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF的表達(dá)情況n(%)

2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢查結(jié)果: IPA中TNF-α mRNA含量明顯高于NIPA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.92,P<0.05);IPA中IL-6mRNA含量明顯高于NIPA,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.45,P<0.05);IPA中VEGF mRNA含量明顯高于NIPA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.21,P<0.05)。見圖2、表2。

表2 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF mRNA水平表達(dá)結(jié)果

3 討 論

目前,侵襲性垂體腺瘤治療,主要選擇手術(shù)作為治療方法,這樣可以最大限度地消除占位效應(yīng),但術(shù)后也會(huì)發(fā)生很多腦脊液漏、尿崩等并發(fā)癥。通過實(shí)驗(yàn)觀察TNF-α、IL-6和VEGF三項(xiàng)指標(biāo)在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)水平明顯高于無侵襲性垂體腺瘤,這也提示三項(xiàng)指標(biāo)對侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生和進(jìn)展可能具有一定的推動(dòng)作用。

TNF-α是一種小分子蛋白質(zhì),是單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在活化過程中產(chǎn)生,無論是病理還是生理,如細(xì)胞免疫、腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)等,TNF-α都起著重要的作用[5]。腫瘤組織之所以會(huì)對病體進(jìn)行侵襲,主要原因在于腫瘤血管的形成,TNF-α在IL-8蛋白表達(dá)方面起著推動(dòng)作用。不僅可以加快腫瘤血管的生長,而且可以加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[6]。出現(xiàn)腫瘤血管后,在IL-8的作用下,血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯收縮,這就加大了血管內(nèi)皮細(xì)胞間空隙,受此影響,腫瘤細(xì)胞侵襲能力得到提高。此外,TNF-α還可以增加內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的粘附力,在這種粘附力的干擾下,腫瘤細(xì)胞大量附著在細(xì)胞外基質(zhì),促使垂體腺瘤細(xì)胞侵襲正常組織與器官的能力得到增強(qiáng),從而促進(jìn)了侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生和進(jìn)展。有研究表明,岡田酸與TNF-α作用具有相似性,比如在二者作用下,熱休克蛋白27與成纖維細(xì)胞波形蛋白將發(fā)生磷酸化,最后形成磷酸化蛋白,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的效果,從刺激效應(yīng)角度分析,TNF-α遠(yuǎn)超于岡田酸,兩者都能引起DNA的損傷[7]。在垂體腺瘤發(fā)展為侵襲性垂體腺瘤的過程中,TNF-α其中可能起到了上述作用。目前,多項(xiàng)研究表明,感染引起的慢性炎癥與多個(gè)生物腫瘤的發(fā)生有一定的相關(guān)性,接近20%[8]。IL-6是臨床上常見的炎癥因子,對侵襲性垂體腺瘤的生長也有一定的作用,作為炎癥信號擴(kuò)增的關(guān)鍵因子,細(xì)胞因子、絲氨酸蛋白酶、粘附分子等是其調(diào)節(jié)基因,腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與這些調(diào)節(jié)基因相關(guān)。作為一種生長因子的IL-6具有多功能自分泌或旁分泌的特點(diǎn),對腫瘤細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)作用,刺激增殖和抑制分化。腦組織內(nèi)的垂體前葉濾泡星形細(xì)胞是產(chǎn)生IL-6的主要部位,在gp130家族中也是重要的信號蛋白之一。血液循環(huán)是IL-6作用于垂體組織的途徑之一,但并非唯一,由于垂體細(xì)胞也能釋放IL-6,其主要作用主要是抑制垂體細(xì)胞生長,減少激素分泌。此外,IL-6可以通過刺激血管生長促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,可以延長腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間,使得腫瘤細(xì)胞凋亡得到延緩,并且能夠令腫瘤細(xì)胞快速生長,進(jìn)而出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和對化療藥物的耐藥性。目前抗腫瘤治療的方法很多,目前被公認(rèn)最有效的方法則是抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。在腫瘤發(fā)展期間,VEGF有推動(dòng)作用,其作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞進(jìn)展和浸潤[9]。腫瘤細(xì)胞生長和侵襲所需的新生血管生成到成熟的過程需要復(fù)雜的多信號和多因子傳遞,這也是腫瘤細(xì)胞生成乃至具有侵襲性的重要條件。最新研究結(jié)果表明,VEGF通過MAPK、PI3K/Akt等途徑誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生作用,顯示激活細(xì)胞增殖的功能。本實(shí)驗(yàn)表明,VEGF在IPA的表達(dá)與在NIPA的表達(dá)相比,前者明顯高于后者,這就意味著垂體腺瘤侵襲生長時(shí), VEGF具有推動(dòng)作用。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)免疫組織化學(xué)及RT-PCR結(jié)果分析,與NIPA相比TNF-α、IL-6、VEGF在IPA組織中在分子、蛋白水平上含量較高,在垂體腺瘤呈現(xiàn)不斷侵襲的狀態(tài)下,這三者接起到促進(jìn)作用,并為治療IPA提供一定靶點(diǎn)的理論依據(jù)。本文的研究采用少量標(biāo)本,以單中心為主,為進(jìn)行更深入的探究,這可能為侵襲性垂體腺瘤的新治療方法提供一定的理論基礎(chǔ),后期將收集更多的樣本進(jìn)行充填。