RNAscope技術(shù)檢測hTERC RNA組分在宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及其應(yīng)用價值

胡倩嵐, 張 爽, 李紅娜, 毛 昕, 劉 芳, 吳晨陽, 宋旭東

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科, 河北 唐山 063000)

在全球女性惡性生殖性腫瘤中,宮頸癌位居第二,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計2020年全球新發(fā)病例超60萬,死亡人數(shù)達(dá)34萬[2]。宮頸癌是目前唯一明確病因的惡性腫瘤,高危型HPV(HR-HPV)感染是主要致癌因素,因此如何有效防止宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,及早預(yù)防、精準(zhǔn)診治是目前研究熱點。研究發(fā)現(xiàn), HR-HPV可導(dǎo)致宮頸鱗狀上皮細(xì)胞3號染色體長臂人端粒酶RNA組分(human telomericRNA component,hTERC)基因異常擴(kuò)增,該基因異常表達(dá)是宮頸腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ),也是宮頸癌形成的早期事件[3]。RNAscope技術(shù)是一項新型RNA原位雜交檢測方法,它利用“Z”型雙探針引物與目標(biāo)RNA序列互補(bǔ)結(jié)合,實現(xiàn)特異性信號放大,使其擁有高靈敏度及特異度,并能在顯微鏡下直接觀察病變中RNA的表達(dá)情況[4,5]。本課題采用RNAscope技術(shù)檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變患者h(yuǎn)TERC RNA組分的表達(dá),探討該技術(shù)在宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變病理診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:篩選2021年9月至2022年2月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科已確診為HR-HPV感染宮頸活檢標(biāo)本80例,由兩位高級職稱病理醫(yī)師按照2020年(第五版)WHO女性生殖器官腫瘤分類行組織病理診斷,其中炎性病例14例(簡稱炎癥組)、低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變34例(簡稱低級別組)、高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變32例(簡稱高級別組)。所有病例均無相關(guān)治療或其他惡性腫瘤放化療史,且臨床資料完備。

1.2熒光原位雜交技術(shù)(FISH):按照試劑盒操作說明對石蠟包埋宮頸組織學(xué)標(biāo)本行FISH檢測,橘紅色熒光素標(biāo)記的TERC探針檢測TERC基因,綠色熒光素標(biāo)記的CEP3探針檢測3號染色體著絲粒序列,雜交信號結(jié)果記錄為綠∶紅,正常細(xì)胞為2∶2型,異常細(xì)胞包括2∶3、2∶4、3∶3、4∶4以及hTERC基因高拷貝型(N:5及以上)等。

1.3RNAscope技術(shù):石蠟切片經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟至水,取出切片在室溫下風(fēng)干5min,滴加雙氧水室溫下10min后蒸餾水清洗,將切片浸入到接近沸騰的靶標(biāo)修復(fù)試劑中,99℃ 15min,然后用蒸餾水清洗切片,在無水乙醇中清洗3～5次,風(fēng)干。疏水筆在每張切片樣本周圍畫疏水圈,室溫下放置至完全干燥。在上述每張切片上加約5滴蛋白酶放入預(yù)熱至40℃的HybEZ濕盒,加蓋密封,放入雜交爐,40℃孵育30min,蒸餾水清洗去除切片上的過量液體,在每張切片上加入4滴探針,置于雜交爐中,40℃孵育2h。取出溫度控制盤,用清洗緩沖液室溫清洗切片2min。擦凈阻水圈周圍的液體,分別依次加入6次雜交反應(yīng)液,反應(yīng)溫度40℃,反應(yīng)時間分別為30min、15min、15min、15min、30min、15min。每次反應(yīng)結(jié)束均用緩沖液清洗玻片。加入配置好的Red工作液,室溫顯色20min,蘇木素復(fù)染、去離子水沖洗。

1.4結(jié)果判讀:FISH結(jié)果判讀:在10×物鏡下查找FISH檢測細(xì)胞區(qū)域,然后在40×物鏡下掃描整個雜交區(qū)域,觀察標(biāo)本的質(zhì)量,隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞,分別記錄正常信號及異常信號細(xì)胞的數(shù)目。正常細(xì)胞信號綠∶紅為2∶2型,異常細(xì)胞包括2∶3、2∶4、2∶5、3∶3型等。以20例正常宮頸組織學(xué)標(biāo)本中FISH檢測結(jié)果建立閾值,閾值=均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差,計算結(jié)果閾值為6%,即異常細(xì)胞數(shù)/計數(shù)細(xì)胞總數(shù)≥6判斷為hTERC基因擴(kuò)增,結(jié)果為陽性。RNAscope結(jié)果判讀:hTERC RNA組分陽性反應(yīng)為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及胞核中可見紫紅色顆粒狀染色,同時根據(jù)陽性細(xì)胞在宮頸鱗狀上皮垂直切面的分布進(jìn)行分級:(+)為基底和基底旁細(xì)胞染色;(++)為表皮下1/3層的細(xì)胞染色;(+++)為超過表皮下1/3層,但未達(dá)到2/3層的細(xì)胞染色;(++++)為超過表皮下2/3層和到全層的細(xì)胞染色。腫瘤細(xì)胞呈陰性反應(yīng)或陽性反應(yīng)僅局限于基底或基底旁者均視為hTERC RNA組分不表達(dá),即(-)與(+)均判讀為hTERC RNA組分陰性表達(dá)(Ⅰ級),(++)染色為Ⅱ級,(+++)和(++++)染色為Ⅲ級。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,FISH和RNAscope檢驗結(jié)果采用配對χ2檢驗;一致性檢驗采用Kappa檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸活檢標(biāo)本中hTERC基因擴(kuò)增情況:80例標(biāo)本中有24例呈hTERC基因擴(kuò)增(見圖1),總擴(kuò)增率為30.0%(24/80),炎癥組、低級別組及高級別組擴(kuò)增陽性率分別為0%(0/14)、23.53%(8/34)及50%(16/32),統(tǒng)計分析三組陽性率比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=12.773,P=0.002),見表1。組間比較,僅高級別組與炎癥組之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。以上結(jié)果提示HR-HPV感染宮頸鱗狀上皮可以引發(fā)hTERC基因擴(kuò)增,并參與宮頸鱗狀上皮瘤變,但hTERC基因擴(kuò)增陽性結(jié)果對宮頸上皮內(nèi)瘤變分級及預(yù)測病變進(jìn)展的幫助有限。

表1 FISH檢測宮頸組織標(biāo)本中hTERC基因擴(kuò)增情況(n)

圖1 FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增情況(×100)A.正常宮頸組織無hTERC基因擴(kuò)增(綠色信號∶紅色信號=2∶2);B.宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變hTERC基因擴(kuò)增陽性(綠色信號∶紅色信號=8∶40)

2.2宮頸活檢標(biāo)本中hTERC RNA組分表達(dá)情況:80例HR-HPV感染的宮頸活檢組織標(biāo)本中有53例hTERC RNA組分呈陽性表達(dá),總陽性率為66.25%(53/80),炎癥組、低級別組及高級別組陽性率分別為0%(0/14)、67.65%(23/34)及93.75%(30/32)(見表2)。三組hTERC RNA組分陽性表達(dá)率的統(tǒng)計學(xué)差異顯著(χ2=38.334,P=0.000),其中炎癥組的陽性率顯著低于宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變組(低級別組及高級別組)(χ2分別為18.184、33.715,P值均為0.000),高級別組的陽性率顯著高于低級別組(χ2=7.101,P=0.008)。以上結(jié)果提示hTERC RNA組分表達(dá)增高參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。參照組織學(xué)分級診斷標(biāo)準(zhǔn),對hTERC RNA組分表達(dá)程度進(jìn)行分級,其中炎癥組hTERC RNA組分陽性表達(dá)程度均為Ⅰ級(-/+)(14/14),低級別組中以Ⅱ級(++)為主(19/34),高級別組中以Ⅲ級(+++/++++)為主(27/32)(見圖2、表3)。統(tǒng)計學(xué)分析示RNAscope檢測hTERC RNA組分分級染色模式在宮頸組織學(xué)分級中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),該結(jié)果提示hTERC RNA組分陽性表達(dá)的程度與宮頸病變級別呈正比,采用RNAscope檢測宮頸組織中hTERC RNA組分的表達(dá)可輔助宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變的組織學(xué)診斷。

表2 RNAscope檢測宮頸組織標(biāo)本中hTERC RNA組分表達(dá)情況

表3 RNAscope檢測分級診斷和組織學(xué)分級診斷情況n(%)

圖2 RNAscope檢測hTERC RNA組分表達(dá)情況(×200)A.正常宮頸組織hTERC RNA組分(-)、B.慢性子宮頸炎hTERC RNA組分(+)、C.宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變hTERC RNA組分(++)、D.宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變hTERC RNA組分(+++)、E.宮頸原位癌hTERC RNA組分(++++)

2.3hTERC RNA組分在宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變一致性分析:將宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變中hTERC RNA組分陽性表達(dá)程度分Ⅰ級(-/+)、Ⅱ級(++)、Ⅲ級(+++/++++),分別對應(yīng)組織學(xué)診斷中的慢性宮頸炎、低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變及高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變。根據(jù)宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變臨床分層管理共識,將宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變及hTERC RNA組分陽性表達(dá)程度重新分為兩級管理(見表4)。依據(jù)表4分析hTERC RNA組分表達(dá)對宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變診斷的靈敏度為84.37%(27/32)、特異度為100%(48/48)、陽性預(yù)測值為100%(27/27)、陰性預(yù)測值為90.57%(48/53)、準(zhǔn)確率為93.75%(75/80),一致性檢驗Kappa值為0.866,一致性顯著。

表4 RNAscope檢測hTERC RNA組分一致性比較

3 討 論

端粒酶是一種維持端粒長度的核蛋白復(fù)合體。hTERC基因是端粒酶上具有11個堿基的模板序列,在端粒延伸過程中起模板作用,同時也是端粒延伸的重要組成部分。該基因異常擴(kuò)增會導(dǎo)致端粒酶表達(dá)過度,致端粒酶延伸,最終造成細(xì)胞惡性循環(huán)增殖而產(chǎn)生腫瘤[3,6]。hTERC基因的表達(dá)與端粒酶活性一致,hTERC在許多正常組織和良性組織中均有表達(dá),但其相對上調(diào)可反映惡性進(jìn)展程度,在惡性腫瘤中高表達(dá)。在宮頸癌和癌前病變中,hTERC也有不同程度的擴(kuò)增,被認(rèn)為是宮頸癌的潛在腫瘤標(biāo)志物[7]。HR-HPV感染是導(dǎo)致hTERC重新激活的起始因子,兩者的聯(lián)合作用使宮頸細(xì)胞獲得無限的增殖能力。目前國內(nèi)外關(guān)于hTERC基因研究也證實了以上觀點,Haizhen He[8]及楊淑玲[9]等研究運用FISH技術(shù)檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率,結(jié)果顯示在宮頸癌中最高,在CIN3中為中度,在CIN1/2類病變中最低,說明hTERC基因在不同宮頸病變的分級診斷中存在明顯差異,即隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加,hTERC基因表達(dá)也增加。本實驗結(jié)果與上述研究一致。

hTERC RNA組分是由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,在疾病的診斷與治療中發(fā)揮重要作用,但極易降解,而RNAscope技術(shù)所具備的高靈敏度及特異度優(yōu)勢可以顯著提高RNA檢出率并能提供有效的組織形態(tài)學(xué)特征。本研究中,hTERC RNA組分在各級宮頸病變中均有表達(dá),但是在宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中hTERC RNA組分檢出率達(dá) 90% 以上,且組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),顯微鏡原位觀察hTERC RNA組分染色范圍也隨著宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變程度的增加從基底層逐漸向表層覆蓋,其染色模式在不同級別的宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),且具有顯著的診斷效能。以上統(tǒng)計分析示,RNAscope 技術(shù)相比于目前主流的FISH技術(shù),它具有更顯而易見優(yōu)勢,如明了染色模式、判讀方便、一致率高等,除此之外,在宮頸病變分級診斷中具有顯著的靈敏度及特異度,并能直觀反應(yīng)病變進(jìn)展情況。在本研究中,FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率無法象RNAscope一樣進(jìn)行分級比較,且組間陽性率比較無統(tǒng)計學(xué)意義,更加突出RNAscope技術(shù)優(yōu)越性。

hTERC RNA組分原位雜交染色最顯著價值是對宮頸組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行染色定位。在本研究中,hTERC RNA組分在炎癥組、低級別組及高級別組中顯示了不同的染色模式,因此可利用hTERC RNA組分原位雜交為基礎(chǔ)來對宮頸病變發(fā)展進(jìn)行推測。眾所周知,HPV感染從病毒損傷鱗狀上皮黏膜基底細(xì)胞層開始,隨后病毒將其基因整合入宿主基因組中并開始大量復(fù)制,最后擴(kuò)散至整個上皮層,并表達(dá)大量E6、E7蛋白,破壞宿主DNA修復(fù)功能和細(xì)胞凋亡,同時上調(diào)端粒酶活性使hTERC基因擴(kuò)增表達(dá),導(dǎo)致上皮細(xì)胞無限增殖,最終導(dǎo)致癌的發(fā)生[10]。本研究中,低級別組大部分病例為表皮下1/3層表達(dá)模式,與復(fù)制期感染過程相符。在高級別病變中,大部分病例表現(xiàn)為表皮下2/3層至全層的染色模式,與轉(zhuǎn)化期感染過程一致。因此可以通過hTERC RNA組分原位染色變化間接地反映了HPV感染過程。故在宮頸上皮內(nèi)瘤變分流診斷中,對于病理診斷不明確或有分歧時,行hTERC RNA組分檢測可輔助組織學(xué)病理診斷以指導(dǎo)臨床治療,對hTERC RNA組分無陽性表達(dá)的CIN1及慢性宮頸炎病例,酌情考慮隨診,以避免過度治療。當(dāng)hTERC RNA組分陽性表達(dá)級別增高時,極大可能為宮頸高級別病變或進(jìn)展為高級別病變,而予以積極治療防止漏診。

綜上所述,采用RNA scope技術(shù)檢測hTERC RNA組分的表達(dá),相對于FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增狀態(tài),更有效地作為宮頸癌前病變的早期篩查輔助手段,并有助于宮頸病變組織學(xué)分級診斷。