miR-105-5p調(diào)控CDC5L表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移的影響

宋海龍, 徐東為, 余秋男, 荊彥平, 李世沖, 劉建中, 劉京讓

(河南省黃河三門峽醫(yī)院神經(jīng)外科, 河南 三門峽 472000)

腦膠質(zhì)瘤是最一種常見的原中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,嚴(yán)重危害患者生命健康[1]。世界衛(wèi)生組織根據(jù)腦膠質(zhì)瘤的病理特性將膠質(zhì)瘤分為I～I(xiàn)V級,I級膠質(zhì)瘤界限明顯,生長緩慢,很少擴(kuò)散;IV級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度高,預(yù)后差,中位生存期不足2年[2]。膠質(zhì)瘤具有細(xì)胞增殖快、血管生成快,轉(zhuǎn)移、侵襲能力強(qiáng)等特點(diǎn),急需探索膠質(zhì)瘤準(zhǔn)確分子機(jī)制和可靠治療靶點(diǎn)以改善相關(guān)疾病。微小RNA(microRNA,miRNA)可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,是腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)之一[3]。微小RNA-105-5p(microRNA-105-5p,miR-105-5p)在前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平下降,并與患者預(yù)后有關(guān),可在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用[4]。細(xì)胞分裂周期蛋白5樣蛋白抗體(Cell division cycle 5-like protein,CDC5L)可參與細(xì)胞周期調(diào)控,通過與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞有絲分裂。研究表明,CDC5L高表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒存活率顯著降低,CDC5L水平被證實(shí)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤不良病理類型及不良預(yù)后有關(guān)[5]。此外,Targetscan數(shù)據(jù)庫分析顯示,miR-105-5p與CDC5L存在結(jié)合位點(diǎn),推測兩者存在靶向調(diào)控關(guān)系,共同作用于細(xì)胞生長。因此本文選擇miR-105-5p、CDC5L進(jìn)行研究,并分析二者與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移的關(guān)系,以期為揭示膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制及靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器:人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供;miR-105-5p mimics及miR-105-5p陰性對照[miR-105-5p模擬物(miR-105-5p mimics)NC]、CDC5L siRNA及陰性對照(CDC5L siRNA NC)、pcDNA-CDC5L及陰性對照(pcDNA)質(zhì)粒均由北京擎科生物有限公司合成;CDC5L、細(xì)胞周期蛋白(CyclinDl)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、MMP-9及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、GAPDH兔單克隆抗體(貨號:ab129114、ab16663、ab92536、ab76003、ab109520、ab181602)均購自英國Abcam公司;Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號:11668030)、熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號:16161)、Trizol試劑(貨號:10296028)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:K16225)均購自Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8試劑盒(貨號:GK10001)購自美國GLPBIO公司。LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司;Epoch酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司;CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2方 法

1.2.1臨床樣本收集:選取本院經(jīng)神經(jīng)外科手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤組織樣本35例,膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未行放、化療,手術(shù)均為開顱切除,并經(jīng)病理檢查證實(shí)為人腦膠質(zhì)瘤,其中男性19例,女性16例,年齡30～68歲;另選因腦外傷行減壓術(shù)的正常腦組織樣本35例作為對照,其中男性18例,女性17例,年齡29～71歲,所有樣本均保存在-80℃冰箱中。所有研究對象均知情同意。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)U251細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。并將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞,分為control組(不處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimics NC)、miR-105-5p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染CDC5L siRNA NC)、si-CDC5L組(轉(zhuǎn)染CDC5L siRNA)、pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimics及CDC5L空載體pcDNA)、miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組(共轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimics及pcDNA-CDC5L)。轉(zhuǎn)染48h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-105-5p、CDC5L表達(dá):采用Trizol試劑提取細(xì)胞及組織樣本中的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體操作按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL):2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL、7 μL ddH2O。在LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀上擴(kuò)展,2-△△Ct法計(jì)算miR-105-5p、CDC5L的相對表達(dá)量,引物序列見表1。

表1 miR-105-5p CDC5L及相應(yīng)內(nèi)參U6 GAPDH的引物序列

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:將1.2.1中各組細(xì)胞鋪于96孔板中(密度為5×103個(gè)/孔),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí),向96孔板中加入10mL CCK-8溶液,孵育2h,酶標(biāo)儀檢測各孔OD值。OD值越大,細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.5Transwell檢測細(xì)胞遷移:制備1.2.1中各組的細(xì)胞重懸液(密度為1×106個(gè)/mL),取200μL加入Transwell小室上室中,下室加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)24h,取出小室,擦除微孔膜上層細(xì)胞,多聚甲醛固定10min,結(jié)晶紫染色5min,鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù),以平均值表示遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Western blot法檢測CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá):提取轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。適量蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉液封閉1h,加入各蛋白對應(yīng)一抗,4℃過夜,加入二抗,室溫孵育2h,ECL顯色、曝光,Quantity One凝膠軟件分析各條帶灰度值。各蛋白水平以目的條帶與GAPDH條帶比值表示。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-105-5p與CDC5L的靶向關(guān)系:Targetscan網(wǎng)站、miRDB網(wǎng)站預(yù)測miR-105-5p與CDC5L 3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)miR-105-5p結(jié)合CDC5L 3’UTR區(qū)域序列,構(gòu)建野生型CDC5L-3’UTR-WT及突變型CDC5L-3’UTR-MUT質(zhì)粒,分別與miR-105-5p mimics或miR-105-5p mimics NC共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48h,收集細(xì)胞并制備細(xì)胞提取物,測量各組熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1膠質(zhì)瘤組織中miR-105-5p、CDC5L mRNA的表達(dá):膠質(zhì)瘤組織miR-105-5p表達(dá)量低于正常腦組織(P<0.05),CDC5L mRNA表達(dá)量高于正常腦組織(P<0.05)。見表2。

表2 膠質(zhì)瘤組織中miR-105-5p CDC5L mRNA的表達(dá)

2.2miR-105-5p靶向調(diào)控CDC5L表達(dá):Targetscan分析顯示,miR-105-5p與CDC5L 3’UTR區(qū)存在特異互補(bǔ)序列,見圖1。miR-105-5p表達(dá)水平與CDC5L表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r= -0.512,P=0.002),見圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,與CDC5L-WT+miR-105-5p NC組相比,CDC5L-WT+miR-105-5p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.05),見表3。

圖1 各組U251細(xì)胞遷移情況

圖2 miR-105-5p與CDC5L 相關(guān)性

表3 各組U215細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

2.3過表達(dá)CDC5L逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對U251細(xì)胞增殖、遷移的作用:與control組、si-NC組比較,si-CDC5L組24h、48h、72h OD值、遷移細(xì)胞數(shù)、CDC5L mRNA表達(dá)量均降低(P<0.05);與control組、miR-NC組比較,miR-105-5p mimics組miR-105-5p表達(dá)量升高[(1.95±0.46)vs(0.99±0.03),P<0.05],24h、48h、72h OD值、遷移細(xì)胞數(shù)、CDC5L mRNA表達(dá)量均降低(P<0.05);與miR-105-5p mimics組、pcDNA組比較,miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組U251細(xì)胞24h、48h、72h OD值、遷移細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05),CDC5L mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 過表達(dá)CDC5L逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對U251細(xì)胞增殖、遷移的作用

2.4過表達(dá)CDC5L逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對U251細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與control組、si-NC組比較,si-CDC5L組p21蛋白表達(dá)量升高(P<0.05),CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05);與control組、miR-NC組比較,miR-105-5p mimics組p21蛋白表達(dá)量升高(P<0.05),CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05);與miR-105-5p mimics組、pcDNA組比較,miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量升高,p21蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。見圖4,表5。

表5 過表達(dá)CDC5L逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對U251細(xì)胞增殖遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有極高的致死率[6]。惡性膠質(zhì)瘤具有彌漫性、浸潤性,腫瘤邊界不清,手術(shù)治療難以完全清除,患者預(yù)后差等特點(diǎn)[7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子靶向治療逐漸成為治療膠質(zhì)瘤的新型途徑,尋找特異性靶點(diǎn)是治療的關(guān)鍵。

miRNA通過與靶基因3’UTR區(qū)結(jié)合,降解靶基因mRNA或抑制翻譯,參與多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活動[8]。miR-105-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA分子[9],已有研究發(fā)現(xiàn)miR-105-5p在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中低表達(dá),過表達(dá)miR-105-5p可抑制細(xì)胞增殖遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,有望成為非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物[10]。此外,miR-105-5p在胃癌細(xì)胞系中的過表達(dá)可導(dǎo)致PD-L1表達(dá)水平下降,并誘導(dǎo)CD8+共培養(yǎng)試驗(yàn)中的T細(xì)胞活化,miR-105-5p有望成為免疫療法的治療靶點(diǎn)[9]。然而,miR-105-5p在膠質(zhì)瘤中的研究極少。本研究結(jié)果表明,miR-105-5p在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平降低,與Suo等[11]研究結(jié)果一致,且過表達(dá)miR-105-5p可抑制U251細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)以及CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白水平,升高p21蛋白水平,表明過表達(dá)miR-105-5p可抑制U251細(xì)胞增殖、遷移提示miR-105-5p參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞行為學(xué)發(fā)展。

為了進(jìn)一步明確miR-105-5p的下游調(diào)控機(jī)制,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CDC5L是miR-105-5p的直接靶點(diǎn),且CDC5L表達(dá)水平與miR-105-5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),推測miR-105-5p可能負(fù)向靶向調(diào)控CDC5L發(fā)揮作用。CDC5L蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)變的必要蛋白,在部分人類體細(xì)胞腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用,CDC5L下調(diào)可導(dǎo)致染色體錯(cuò)誤和有絲分裂停滯,從而降低癌細(xì)胞活力,被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[12,13]。研究顯示,CDC5L在膀胱癌組織中高表達(dá),且與膀胱癌病理分級和Ki-67表達(dá)顯著相關(guān),敲低CDC5L水平可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究通過抑制CDC5L表達(dá)發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞的增殖和遷移能力降低,與Chen等研究一致[15],證實(shí)CDC5L可影響細(xì)胞增殖、遷移。為證實(shí)miR-105-5p通過調(diào)控CDC5L發(fā)揮作用,本研究在miR-105-5p表達(dá)的同時(shí)過表達(dá)CDC5L,發(fā)現(xiàn)CDC5L可逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的調(diào)控作用,進(jìn)一步證實(shí)過表達(dá)CDC5L可抑制過表達(dá)miR-105-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移抑制,同時(shí)減弱miR-105-5p對CyclinDl、MMP-2、MMP-9、p21蛋白的影響。

綜上所述,過表達(dá)miR-105-5p通過靶向下調(diào)CDC5L表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移。