CircRNA YAP1對股骨頭微血管內皮細胞血管生成的作用研究

日夏提·帕爾哈提, 翟 生, 呂 青

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院骨科中心, 新疆 烏魯木齊 830000)

類固醇糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)頻繁大量使用可引起激素性股骨頭壞死(steroids-induced ONFH,SONFH),這是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要類型[1,2]。SONFH目前具說服力的科學假說之一是GCs的使用顯著抑制了股骨頭血管生長,導致股骨頭供血減少引起骨壞死[3]。然而,該過程的具體調控機制至今未明。Wnt/β-catenin信號在多種腫瘤模型和疾病中參與血管生成的調控,也包括股骨頭壞死模型,最近研究表明,Wnt/β-catenin信號可被多個結構穩(wěn)定的環(huán)狀RNA(circRNA)密切調控[4]。yes相關蛋白1(YAP1)由位于人類染色體11q22a(17,18)的YAP基因編碼,在SONFH中密切調控血管的管形態(tài)發(fā)生[5],circRNA YAP1是最近被發(fā)現的來源于YAP1的circRNA,已明確circRNA YAP1可以促進BMSC和前成骨細胞的成骨分化[4]。但是,circRNA YAP1對微血管內皮細胞生長的作用并不清楚,盡管YAP1已經被證實能激活Wnt1/β-catenin信號并可以促進骨血管的生成[6],但是circRNA YAP1對SONFH中的Wnt1/β-catenin信號蛋白和骨血管生成調控作用不清楚。因此,本研究分離了SONFH模型大鼠的股骨頭微血管內皮細胞(microvascular endothelial cell,MVECs),進行培養(yǎng),并觀察MVECs細胞過表達circRNA YAP1對股骨頭MVECs血管生成的影響,并基于Wnt1/β-catenin信號探討circRNA YAP1的調控機制。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:無特定病原(Specified Pathogen Free,SPF)級成年雄性SD大鼠(體重250g±20g)60只購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。甲基強的松龍購于上海輝瑞公司。pcDNA3.1+真核過表達載體空質粒(pcDNA-NC)、過表達circRNA YAP1的pcDNA3.1+真核表達載體粒(pcDNA-YAP1)、Lipofectamine?3000均購于上海吉瑪公司。Wnt1/β-catenin信號通路拮抗劑dickkopf-1購于美國MCE公司?；|膠Matrigel購于美國BD公司。兔抗-CD31、Wnt1、β-catenin、VEGF-A和Vimentin的一抗和驢抗兔二抗以及FITC偶聯的山羊抗兔二抗均購于英國Abcam公司。

1.2動物給藥和分組:隨機數表法將60只大鼠分為兩組,分別命名為SONFH組和Ctrl組,每組n=30。SONFH組,肌肉注射甲基強的松龍20mg·kg-1·d-1,每周連續(xù)3d,每天1次,連續(xù)3周。Ctrl組,肌肉注射生理鹽水,注射體積及頻率同SONFH組。3周后 micro-CT掃描觀察股骨頭的形態(tài)學變化。并測量Ctrl組和SONFH組的空骨陷窩、骨小梁數目以及骨小梁長度的變化。隨后按照隨機數表法分配各組大鼠的后續(xù)實驗研究,包括蘇木素伊紅(HE)染色(10只)、股骨頭MVECs的分離培養(yǎng)(10只),qRT-PCR實驗(5只)和Western blot實驗(5只)。

1.3HE染色:將1.2中用于HE染色的各組大鼠安樂死,并分離股骨頭組織,根據HE染色試劑盒提供的說明進行染色,用以檢測股骨頭的病理變化。固定脫鈣后,取體積為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小的組織(組織表面積為2.5 cm2)。切片固定,行HE染色酒精脫水,二甲苯清洗3次,中性香脂封片。最后,在顯微鏡下獲得圖像。

1.4股骨頭MVECs分離培養(yǎng):將1.2中用于股骨頭MVECs分離培養(yǎng)的各組大鼠安樂死,無菌條件下急性分離Ctrl組和SONFH組的股骨頭組織,用手術刀片削去軟組織和軟骨,用骨鉗將股骨頭內的松質骨咬成骨粒轉入裝有DMEM培養(yǎng)基的50mL離心管。根據文獻進行MVECs的分離純化[7,8]。使用免疫熒光標記法評估細胞純度。將分離得到的Ctrl組和SONFH組的MVECs用含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,培養(yǎng)條件為37℃,5% CO2。直接收集細胞用于qPCR和Western blot檢測。另外,將SONFH組的MVECs繼續(xù)培養(yǎng)(條件同上,每24h換液)用于細胞轉染和給藥處理。

1.5免疫熒光法檢測CD31鑒定股骨頭的MVECs:收集Ctrl組和SONFH組貼壁的MVECs爬片,4%甲醛固定細胞15min,用0.5%Triton X-100進行20min灌通。用PBS洗3次。隨后用抗體封閉液封閉30min.。細胞用CD31(1∶500)一抗室溫孵育細胞12h。然后將載玻片與FITC偶聯山羊抗兔二抗(1∶5000)在37℃孵育1h。細胞核用DAPI染色(1∶5000)。在熒光顯微鏡(萊卡,德國)下觀觀察并獲取圖像。用ImageJ軟件計算平均熒光強度。

1.6細胞轉染和分組:根據制造商的說明,使用Lipofectamine?3000試劑對MVECs細胞進行轉染。將來源于SONFH組的MVECs細胞接種于6孔板(20萬細胞/孔)中。細胞分為pcDNA-NC組、pcDNA-YAP1組、pcDNA-YAP1+dickkopf-1組,共3組。pcDNA-NC組細胞用8μg/mL的pcDNA-NC轉染24h。pcDNA-YAP1組細胞用8μg/mL的pcDNA-YAP1轉染24h。pcDNA-YAP1+dickkopf-1組細胞用500μg/L dickkopf-1同時聯合8μg/mL的pcDNA-YAP1轉染24h。收集各組細胞沉淀進行后續(xù)分析。

1.7qRT-PCR檢測circRNA YAP1的表達:收集1.2中用于qRT-PCR檢測大鼠的股骨頭組織、1.3中分離純化的MVECs細胞、1.4中各組MVECs細胞,根據制造商說明使用Trizol試劑提取總RNA。根據制造商說明將提取的總RNA反轉錄為cDNA。采用StepOnePlusTM系統(tǒng)和SYBR Green Master Mix進行qPCR實驗。GAPDH作為內參基因。用相對定量方法(2-ΔΔCt)計算表達水平的倍數變化。引物由上海生工生物技術有限公司合成:circ RNA YAP1 正:5’-TGCTGTCCCAGATGAACGTC-3’;circ RNA YAP1 反:5’-GGTTCATGGCAAAACGAGGG-3’。GAPDH 正:5'-ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG-3';GAPDH 反:5’-CTG GAA GAT GGT GAT GGG TT-3'。

1.8Western blot:收集1.2中用于Western blot檢測的大鼠股骨頭組織,1.3中分離純化的MVECs細胞,1.4中各組MVECs細胞,用RIPA裂解緩沖液提取各組細胞蛋白樣品,用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電泳后蛋白轉移到PVDF膜,用5%脫脂奶粉室溫下封閉60min。PVDF膜分別與Wnt1(1∶1000)、β-catenin(1∶1000)、VEGF-A(1∶1000)、vimentin(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)的一抗在4℃孵育過夜。接下來,用TBST中洗掉膜上抗體,并與二抗(1∶2000)在室溫孵育60min,顯色后使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。GAPDH作為內參蛋白。

1.9CCK-8法檢測細胞增殖能力:根據CCK-8試劑盒制造商的說明。將1.4中的各組MVECs細胞接種至6孔板(5×103個/孔)孵育24h,隨后細胞與CCK-8共孵育2h,之后使用酶標儀在450nm處測量光密度(OD)值。

1.10細胞遷移實驗:用美國康寧Transwell測定室檢測細胞的遷移能力。將1.4中的各組MVECs細胞(1×104/200μL DMEM+1% FBS)裝入上孔,下孔插入24孔板,下孔中有500μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后,將上層遷移至下層的細胞用4%中性緩沖福爾馬林固定,0.1%結晶紫染色15min。在顯微鏡下觀察通過統(tǒng)計遷移細胞數來量化遷移率。

1.11小管形成實驗:在24孔板中預先涂抹200μL的人工基質膠Matrigel。將1.4中的各組MVECs細胞(每孔1×105個細胞)接種到培養(yǎng)皿中,與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。在顯微鏡下觀察毛細血管樣結構,通過計算每孔管的數量來量化成管能力。

2 結 果

2.1大鼠circRNA YAP1和Wnt1/β-catenin信號通路蛋白的表達:造模3周后,micro-CT掃描結果和HE染色顯示Ctrl組的10只大鼠股骨頭均表現為健康狀態(tài),無壞死,骨小梁致密規(guī)則,無空骨陷窩,而SONFH組10只大鼠均出現重度股骨頭壞死,包括股骨頭形態(tài)惡化,伴有大量的空骨陷窩,骨小梁數目減少,骨小梁長度減小特征(圖1A和1B)。表明SONFH的造模成功。與Ctrl組比,SONFH組股骨組織中Wnt1和β-catenin的蛋白表達量均顯著減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.009,0.012),見圖1C和表1。而與Ctrl組比,SONFH組股骨組織中circRNA YAP1的表達水平也明顯降低(約73%),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014),見表1。

表1 大鼠股骨組織中Wnt1和β-catenin蛋白和circRNA YAP1的表達水平

圖1 大鼠股骨組織和Wnt1/β-catenin信號通路蛋白的表達的觀察A.micro-CT對大鼠股骨頭掃描的結果(200×);B.HE染色觀察大鼠股骨頭組織病理變化,黑色箭頭表示空骨陷窩(200×);C.Western blot法檢測Wnt1/β-catenin信號通路蛋白Wnt1和β-catenin在股骨頭組織中的表達變化

2.2股骨頭MVECs的鑒定:用免疫熒光分析細胞中表達的CD31以鑒定分離的股骨頭MVECs?？梢娂毎尸FCD31綠色熒光,經過統(tǒng)計兩組MVECs的純度超過95.0%,見圖2,表明Ctrl組和SONFH組的股骨頭MVECs分離純化成功。

圖2 熒光顯微鏡下用CD31鑒定股骨頭MVECs(200×)

2.3股骨頭MVECs中circRNA YAP1、Wnt1、β-catenin的表達:與Ctrl組比,SONFH組MVECs中circRNA YAP1的表達水平明顯降低(約85%),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014,表2)。與Ctrl組比,SONFH組MVECs中Wnt1和β-catenin的蛋白表達量均顯著減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.005,0.007),見圖3和表2。

表2 大鼠股骨頭MVECs中circRNA YAP1 Wnt1 β-catenin的表達水平

圖3 Western blot法大鼠股骨頭MVECs中Wnt1/β-catenin信號通路蛋白的表達

2.4circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進股骨頭MVECs增殖:與pcDNA-NC組比,pcDNA-YAP1組的circRNA YAP1表達上調(P<0.05),而且pcDNA-YAP1組的Wnt1和β-catenin表達均上調(均P<0.05),見圖4和表3。與pcDNA-YAP1組比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1組的circRNA YAP1表達變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而Wnt1和β-catenin的表達均下調(均P<0.05),見圖4和表3。與pcDNA-NC組比,pcDNA-YAP1組的股骨頭MVECs的增殖率明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與pcDNA-YAP1組比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1組增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進股骨頭MVECs增殖

圖4 Western blot法檢測circRNA YAP1過表達和Wnt信號阻斷對Wnt1和β-catenin表達的影響

2.5circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進大鼠血管內皮細胞的遷移:與pcDNA-NC組比,pcDNA-YAP1組的股骨頭MVECs的遷移細胞數明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與pcDNA-YAP1組比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1組遷移細胞數明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5和表4。

表4 circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進股骨頭MVECs的遷移

圖5 Transwell 小室法檢測circRNA YAP1過表達和Wnt信號阻斷對細胞遷移數的影響(400×,結晶紫染色)

2.6circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進大鼠血管內皮細胞的血管生成:與pcDNA-NC組比,pcDNA-YAP1組的股骨頭MVECs的管形成數和分枝節(jié)點數均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),而與pcDNA-YAP1組比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1組管形成數和分枝節(jié)點數明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖5A和表5。與pcDNA-NC組比,pcDNA-YAP1組的血管生成標志物Vimentin和VEGF-A的蛋白表達水平均上調(均P<0.05),而與pcDNA-YAP1組比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1組Vimentin和VEGF-A的蛋白表達水平都降低(均P<0.05)。見圖6和表5。

表5 circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進股骨頭MVECs的血管形成

圖6 Tube形成實驗檢測circRNA YAP1過表達和Wnt信號阻斷對細胞血管生成的影響(400×)

3 討 論

在本研究中,SONFH大鼠股骨頭組織中circRNA YAP1表達均較Ctrl組下調。其次,在分離的大鼠股骨頭MVECs中觀察到一致的結果。這表明了circRNA YAP1在SONFH中可能扮演重要作用。對SONFH組的MVECs過表達circRNA YAP1可明顯觀察到促進股骨頭MVECs細胞的增殖、遷移、血管生成能力均增加,同時Wnt1/β-catenin信號蛋白表達增加。而當使用Wnt1/β-catenin信號的拮抗劑dickkopf-1后,circRNA YAP1過表達對MVECs細胞的增殖、遷移、血管生成的誘導作用被明顯削弱。這表明,circRNA YAP1通過Wnt1/β-catenin信號通路促進SONFH MVECs的遷移和血管生成。

本研究利用強的龍松干預3周,明顯誘導了大鼠的股骨頭壞死,這與以往的研究報道一致[8]。經過分離MVECs,本研究在體外觀察到SONFH組股骨頭MVECs的增殖率明顯低于Ctrl組,證實了GCs可抑制MVECs的增殖。據報道,GCs加速了SONFH大鼠股骨頭MVECs的凋亡,并引起不少數量的非編碼RNA的差異表達[8]。本研究發(fā)現強的龍松導致股骨頭組織以及體外股骨頭MVECs中的circRNA YAP1都明顯下調。表明circRNA YAP1很有可能參與了股骨頭MVECs的調控。因此,為了觀察circRNA YAP1對股骨頭MVECs,本研究在體外過表達了circRNA YAP1,結果顯著促進了SONFH大鼠股骨頭MVECs的遷移能力和管結構形成能力。本研究通過進一步驗證血管生成標志物VEGF-A和vimentin的表達,發(fā)現circRNA YAP1過表達能夠明顯上調VEGF-A和vimentin的蛋白表達,從而進一步確認了circRNA YAP1對MVECs血管生成具有促進作用。這些結果表明,circRNA YAP1在促進SONFH大鼠股骨頭血管生成中具有重要作用。

Wnt1/β-catenin信號通路在內皮血管生成中具有重要作用,例如,激活Wnt1/β-catenin信號通路可以促進糖尿病視網膜病變患者視網膜血管新生,在血管生成中發(fā)揮重要作用[9],其可以通過促進血管內皮細胞的增殖和遷移以及血管生成因子VEGFA的表達來促進血管生成[10]。本研究發(fā)現SONFH大鼠股骨頭組織和MVECs中Wnt1/β-catenin的表達均較Ctrl組下調,而且股骨頭MVECs細胞中過表達circRNA YAP1促進了Wnt1/β-catenin信號通路的激活。研究表明,在骨髓間充質干細胞和前成骨細胞中circRNA YAP1也可以激活Wnt1/β-catenin信號通路[4],這支持了本研究的結果。另外,dickkopf-1蛋白是特異性Wnt/β-Catenin信號通路的天然抑制劑,可以介導SONFH的調控,如敲低dickkopf-1可減少地塞米松誘導股骨頭壞死中的BMSCs凋亡[11]。本研究發(fā)現過表達circRNA YAP1可以激活Wnt1/β-catenin信號通路,但是利用dickkopf-1蛋白阻斷Wnt1/β-catenin信號通路卻并不影響circRNA YAP1的表達,但卻減弱了過表達circRNA YAP1對大鼠股骨頭MVECs的增殖能力、細胞遷移能力、管結構形成能力、VEGF-A、vimentin的促進作用。表明circRNA YAP1是Wnt1/β-catenin通路的上游調控靶點,通過激活Wnt1/β-catenin信號通路促進SONFH股骨頭MVECs的遷移和血管生成。

綜上所述,本研究結果表明,SONFH大鼠股骨頭中circRNA YAP1下調,而circRNA YAP1在體外過表達可以明顯促進MVECs的血管生成,此功能表明circRNA YAP1可用于預防或治療激素誘導的股骨頭壞死。在機制方面,我們發(fā)現circRNA YAP1通過激活Wnt1/β-catenin通路促進SONFH 股骨頭MVECs的血管生成。