miR-146a調(diào)控JNK信號通路對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

孫偉 何萌萌 邵春芝 宋云超

在臨床治療過程中,大量難治性低氧血癥危重患者需要高氧治療,但是,長期暴露于高水平的氧氣會導(dǎo)致急性肺損傷,并可能導(dǎo)致新生兒支氣管肺發(fā)育不全和成人急性呼吸窘迫綜合征[1]。在高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷中,高氧可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡和壞死[2]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一種由18～22個核苷酸組成的小型非編碼RNA,在全身組織和器官中廣泛表達(dá)。miRNA參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、代謝和其他生物過程。根據(jù)報(bào)道,miR-146a在過氧化氫刺激的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中低表達(dá),同時檢測到細(xì)胞凋亡的增加[3]。miR-146a可以減輕煙霧刺激的小鼠炎性反應(yīng),調(diào)節(jié)吸入性肺損傷進(jìn)程[4]。這些結(jié)果提示,miR-146a對肺損傷具有一定的保護(hù)作用,但其機(jī)制尚未完全明了。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路是高氧肺損傷中的關(guān)鍵傳導(dǎo)途徑[5],此外,JNK也是miR-146a的下游靶點(diǎn)之一[6]。基于此,本研究探討miR-146a、JNK信號通路與高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 肺泡上皮細(xì)胞A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco,miR-146a mimic購自廣州RiboBio公司,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、錳(Mn)SOD檢測試劑盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成公司,膜聯(lián)蛋白(Annexin V)V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基公司,miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA RT-PCR試劑盒購自北京天根公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 肺泡上皮細(xì)胞A549在RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng),生長環(huán)境為37℃、5% CO2。當(dāng)肺泡上皮細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,將其分為Con(對照)組、Model(模型)組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組、Model+miR-146a+Anisomycin組。其中,Model組高氧處理時,培養(yǎng)箱中通入高純混合氣體(3 L/min),包含O2(900 ml/L)和CO2(50 ml/L)[7],保持10 min,之后密閉培養(yǎng)。Model+miR-NC組、Model+miR-146a組分別將miR-NC、miR-146a mimic通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至肺泡上皮細(xì)胞,24 h后進(jìn)行高氧處理。Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimic并加入10 μmol/L JNK信號通路激活劑Anisomycin,24 h后進(jìn)行行高氧處理。

1.3 試劑盒檢測SOD、MnSOD活性和MDA含量 收集各組肺泡上皮細(xì)胞A549上清液,遵循SOD、MnSOD和MDA檢測試劑盒的操作步驟,檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MnSOD活性和MDA含量。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙重染色法評估細(xì)胞凋亡 收集肺泡上皮細(xì)胞A549,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中洗滌2次,然后重新懸浮在結(jié)合緩沖液中。然后將AnnexinV-FITC和PI添加到樣品中。在室溫下于黑暗中孵育15 min,再次用結(jié)合緩沖液稀釋樣品,并在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞的百分比。測量Annexin V+/PI-(早期凋亡)和Annexin V+/PI+(晚期凋亡)凋亡細(xì)胞之和。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析活化的(Cleaved)-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)、pro-caspase3、磷酸化JNK(p-JNK)表達(dá) 肺泡上皮細(xì)胞A549用冰冷的PBS洗滌2次,在冰冷的RIPA緩沖液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物,在使用前加入)中裂解10 min。將細(xì)胞裂解物在4℃下以12 000 r/min離心10 min,并收集上清液。用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白測定試劑盒測定上清液的蛋白含量。將蛋白樣品的等分試樣(30 μg)在12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上分級分離,并印跡到PVDF膜。在室溫下用5%(w/v)的脫脂奶粉在PBS中封閉1 h后,用特異的一抗在4℃下過夜探測膜。然后將膜洗滌3次,并在室溫下暴露于辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗2 h。再次清洗膜3次后,用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)觀察抗原-抗體條帶。所用一抗為艾博抗公司的Cleaved-caspase3(1∶1 000稀釋)、pro-caspase3(1∶1 000稀釋)、p-JNK(1∶1 000稀釋)和對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：1 000稀釋)抗體。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測miR-146a表達(dá) 使用TRIzol試劑從肺泡上皮細(xì)胞中提取總RNA。RNA的濃度和質(zhì)量使用Nanodrop ND2000紫外分光光度法進(jìn)行測量。隨后,通過RT從1 μg RNA中獲得cDNA,并保存在-20℃下。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行miRNA的RT。U6作為內(nèi)部參照,使用miRNA RT-PCR試劑盒測定miR-146a的表達(dá)。使用的引物序列如下：miR-146a 5’-CGGCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’(正向)和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(反向);U6 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反應(yīng)方案包括在95℃初始變性5 min,然后95℃變性10 s,在60℃退火20 s和在72℃延伸10 s(40 cycles)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-146a對U6的相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組肺泡上皮細(xì)胞中SOD和MnSOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);與Model組或Model+miR-NC組相比,Model+miR-146a組肺泡上皮細(xì)胞中SOD和MnSOD活性升高,MDA含量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Model組與Model+miR-NC組肺泡上皮細(xì)胞中SOD、MnSOD活性和MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 n=3,

2.2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平提高,pro-caspase3蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Model組或Model+miR-NC組相比,Model+miR-146a組肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平降低,pro-caspase3蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Model組與Model+miR-NC組2組肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率、Cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1,表2。

圖1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響;A Western blot檢測miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞caspase3蛋白表達(dá)的影響;B 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

表2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響 n=3,

2.3 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞中JNK信號通路的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組降低肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平,而提高p-JNK蛋白表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Model+miR-146a組肺泡上皮細(xì)胞的miR-146a表達(dá)水平高于Model組或Model+miR-NC組,p-JNK蛋白表達(dá)水平低于Model組或Model+miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Model組與Model+miR-NC組肺泡上皮細(xì)胞中miR-146a、p-JNK蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2,表3。

圖2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞中JNK信號通路的影響

表3 miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞中JNK信號通路的影響 n=3,

2.4 JNK信號通路激活劑能逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Model+miR-146a組相比,Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細(xì)胞的SOD、MnSOD活性降低,MDA含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 Anisomycin逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 n=3,

2.5 JNK信號通路激活劑能逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響 與Model+miR-146a組相比,Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細(xì)胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平升高,pro-caspase3蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 Anisomycin逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響;A 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響;B Western blot檢測肺泡上皮細(xì)胞caspase3蛋白表達(dá)的影響

表5 Anisomycin逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響 n=3,

3 討論

高氧引起的急性肺損傷是最難治的疾病之一,迄今為止,其具體機(jī)制尚未完全了解。肺泡上皮細(xì)胞是高氧的主要靶細(xì)胞,其凋亡被認(rèn)為是高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)病機(jī)制的潛在機(jī)制[8]。已有報(bào)道,抑制肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡可有效降低高氧誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[9]。因此,肺泡上皮細(xì)胞凋亡是高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷的關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激在急性肺損傷的機(jī)制中起重要作用。高氧損傷會造成氧化應(yīng)激,它優(yōu)先氧化細(xì)胞中的心磷脂和其他類型的脂質(zhì),這一事件導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。高氧誘導(dǎo)的肺損傷,尤其是嚴(yán)重的肺上皮細(xì)胞死亡,擾亂了肺的正常修復(fù)過程,并在浸潤性免疫細(xì)胞極少參與的情況下促進(jìn)了纖維化反應(yīng)[10]。本研究將肺泡上皮細(xì)胞暴露于高氧中,發(fā)現(xiàn)MDA水平升高,SOD活性降低[11],細(xì)胞凋亡增加[12],證實(shí)了高氧肺損傷模型的有效建立。

miR-146a被報(bào)道與多種病理狀況有關(guān),包括腫瘤發(fā)展[13,14]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[15]、肺[16]、腎[17]、肝[18]和心血管[19]等疾病。研究表明,miR-146a在大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷中呈低表達(dá),miR-146a介導(dǎo)遠(yuǎn)端缺血后處理保護(hù)肢體缺血再灌注后引起的肺損傷的機(jī)制[20]。與健康受試者相比,百草枯中毒引起的肺損傷患者中miR-146a的表達(dá)顯著降低。模擬轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-146a下調(diào)了肺巨噬細(xì)胞中白介素-6的表達(dá),調(diào)節(jié)百草枯中毒引起的肺損傷的發(fā)生和免疫反應(yīng)[21]。在博來霉素構(gòu)建的肺纖維化模型中,小鼠組織中的miR-146a表達(dá)降低,miR-146a過表達(dá)時轉(zhuǎn)化生長因子β1引起的肺成纖維細(xì)胞凋亡被抑制[22]。糖尿病腎病大鼠血清miR-146a低表達(dá),與糖尿病腎病模型中MDA含量呈負(fù)相關(guān)、SOD活性呈正相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn),高氧下肺泡上皮細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平降低,與前人研究[20]一致。過表達(dá)miR-146a后,高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞SOD、MnSOD活性、pro-caspase3蛋白水平顯著升高,MDA含量、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低,說明miR-146a可以有效減輕高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激,抑制其凋亡,從而保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞免受高氧損傷。

許多研究報(bào)道JNK信號通路與高氧下的肺損傷有關(guān)。例如,暴露于高氧的新生大鼠肺損傷模型檢測到p-JNK、JNK蛋白表達(dá)的升高[24],JNK信號通路被激活,并促進(jìn)高氧下肺損傷細(xì)胞的凋亡[25],本研究觀察到相同的結(jié)果。此外,miR-146a能夠降低高氧下肺泡上皮細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)水平,提示miR-146a發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與JNK信號通路有關(guān)。此前已有報(bào)道指出,miR-146a通過JNK和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路模擬改善創(chuàng)傷性腦損傷[26]。雷公藤紅素可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷,并通過上調(diào)miR-146a使JNK和NF-κB通路失活[27]。長鏈非編碼RNA SNHG16通過競爭性結(jié)合miR-146a-5p和CCL5進(jìn)一步介導(dǎo)JNK和NF-κB途徑,調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞WI-38炎癥損傷[28]。本實(shí)驗(yàn)中,miR-146a抑制JNK信號通路活性,JNK信號通路激活劑Anisomycin能逆轉(zhuǎn)miR-146a對高氧下肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抑制作用。這些結(jié)果表明,miR-146a通過抑制JNK信號通路從而改善高氧下肺泡上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述,miR-146a在高氧下肺泡上皮細(xì)胞中低表達(dá),其過表達(dá)可以減輕高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,作用機(jī)制與抑制JNK信號通路活性有關(guān),提示miR-146a可能成為肺損傷中基于miRNA療法的潛在治療靶點(diǎn)。