基于CIBERSORT方法評(píng)價(jià)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系:一項(xiàng)TCGA數(shù)據(jù)集二次分析*

張文思 陳曉蓉 楊宗國(guó)

上海市公共衛(wèi)生臨床中心 中醫(yī)科 (上海, 201508)

肝細(xì)胞癌(HCC)目前被認(rèn)為是一種發(fā)生于慢性肝病引起慢性肝臟炎癥的免疫原性癌癥[1-5]。在慢性肝臟炎癥過(guò)程中,固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞與肝組織細(xì)胞相互作用,被各種分子機(jī)制激活,促進(jìn)肝損傷和HCC腫瘤免疫原性[6]。最近的研究證據(jù)表明,各種免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有密切的相互作用。在肝癌形成過(guò)程中涉及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的許多分子機(jī)制也對(duì)免疫系統(tǒng)有相當(dāng)大的影響[3]。

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境的一部分,與包括HCC在內(nèi)的各種人類(lèi)癌癥的臨床預(yù)后相關(guān)[2,7]。特定類(lèi)型的免疫細(xì)胞不僅涉及宿主對(duì)腫瘤的防御[8],而且通過(guò)選擇更適合在免疫活性宿主中存活的腫瘤細(xì)胞或通過(guò)在可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的腫瘤微環(huán)境中建立條件來(lái)加速促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9]。此外,腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在HCC預(yù)后中的預(yù)后作用仍存在爭(zhēng)議,特異性免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)展具有雙重作用[9-11]。CIBERSORT對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的反卷積提供了有關(guān)HCC患者免疫細(xì)胞組成和預(yù)測(cè)值的寶貴信息[12-14]。本研究中,我們通過(guò)應(yīng)用CIBERSORT方法研究腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相對(duì)比例和分布,以及與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)源 肝細(xì)胞癌患者基于HTSeq-FPKM平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組數(shù)據(jù)共享數(shù)據(jù)門(mén)戶。本研究下載了包括Cart、Manifest和Metadata在內(nèi)的文件,共獲得了374例腫瘤樣本和50例非腫瘤樣本。

1.2 CIBERSORT分析 通過(guò)估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)子集進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型識(shí)別的CIBERSORTfa是一種使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)組織樣本的細(xì)胞類(lèi)型組成的反卷積算法[12]。CIBERSORT基因特征矩陣,稱(chēng)為L(zhǎng)M22,包含547個(gè)基因,可區(qū)分22種人類(lèi)造血細(xì)胞表型,包括7種T細(xì)胞類(lèi)型、初始和記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、NK細(xì)胞和髓系亞群。來(lái)自TCGA-LIHC的所有樣本都通過(guò)CIBERSORT分析了免疫細(xì)胞譜,其缺省特征矩陣為100個(gè)排列[12]。每個(gè)樣本的22種免疫細(xì)胞類(lèi)型以及CIBERSORT指標(biāo)作為Pearson相關(guān)系數(shù)、CIBERSORTP值和均方根誤差被量化。CIBERSORTP值反映了所有細(xì)胞子集的反卷積結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性,可用于過(guò)濾掉擬合精度不太顯著的反卷積。只有CIBERSORTP<0.05的數(shù)據(jù)被過(guò)濾并選擇用于以后的分析。在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的樣本中,最終以CIBERSORTP≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)納入了2例非腫瘤樣本和30例腫瘤樣本。

1.3 生存分析 從cBioPortal for Cancer Genomics(https://www.cbioportal.org/)下載TCGA-LIHC的臨床數(shù)據(jù)[15,16]。VLOOKUP函數(shù)用于匹配巨噬細(xì)胞M0和M1與TCGA-LIHC中的臨床數(shù)據(jù)。研究納入了包括總生存期(OS)和無(wú)病生存期(DFS)在內(nèi)的HCC結(jié)局指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用R語(yǔ)言中heatmap包(https://cran.rproject.org/web/packages/pheatmap/)對(duì)腫瘤和非腫瘤組織之間的免疫細(xì)胞進(jìn)行熱圖分析,使用corrplot包(https://cran.rproject.org/web/packages/corrplot/index.html)進(jìn)行免疫細(xì)胞的相關(guān)分析。Graphpad Prism v8.0(GraphPad Software,CA,US)用于統(tǒng)計(jì)分析,Student'st檢驗(yàn)或Mann-WhineyU檢驗(yàn)用于比較不同臨床病理特征的巨噬細(xì)胞分布差異。雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIBERSORT免疫細(xì)胞組分的比較 以CIBERSORTP≤0.05為標(biāo)準(zhǔn),從所有肝癌樣本中納入了2例非腫瘤樣本和30例腫瘤樣本,如圖1所示。與非腫瘤組織相比,巨噬細(xì)胞M0在腫瘤組織中顯著浸潤(rùn)。巨噬細(xì)胞M1在HCC患者的非腫瘤組織中顯著高于腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞。圖2描述了HCC中腫瘤組織和非腫瘤組織之間22種免疫細(xì)胞的分布圖。圖3描述了腫瘤組織和非腫瘤組織中免疫細(xì)胞的分布熱圖。

圖1 腫瘤組織與非腫瘤組織中免疫細(xì)胞分布差異

圖2 腫瘤組織與非腫瘤組織22種免疫細(xì)胞分布圖

圖3 腫瘤組織和非腫瘤組織中免疫細(xì)胞的分布熱圖

2.2 免疫細(xì)胞的相關(guān)性 圖4顯示,基于CIBERSORT所選樣本的免疫細(xì)胞之間Pearson相關(guān)性。在所有其他具有巨噬細(xì)胞M1的免疫細(xì)胞中,所有Pearson相關(guān)性都<0.5或>-0.5。

圖4 基于CIBERSORT所選樣本的免疫細(xì)胞之間Pearson相關(guān)性

2.3 HCC患者巨噬細(xì)胞M0和M1的生存分析 在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中,361例病例在匹配臨床數(shù)據(jù)和巨噬細(xì)胞CIBERSORT分?jǐn)?shù)后被納入分析。如圖5A-B所示,與M0低浸潤(rùn)的患者相比,腫瘤組織中巨噬細(xì)胞M0高浸潤(rùn)的HCC患者其OS和DFS顯著縮短(HR=2.06,95%CI=1.45～2.93,P<0.001和HR=1.58,95%CI=1.17～2.14P=0.004)。圖5B-C示,HCC患者中巨噬細(xì)胞M1浸潤(rùn)程度與OS和DFS之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖5 M0和M1浸潤(rùn)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 巨噬細(xì)胞M0與臨床病理特征的相關(guān)性 如圖6所示,在甲胎蛋白(AFP)升高的HCC患者中,巨噬細(xì)胞M0的CIBERSORT分?jǐn)?shù)顯著增加(P<0.05)。與AJCC Ⅰ期患者相比, AJCC Ⅱ-Ⅳ期HCC患者的CIBERSORT巨噬細(xì)胞M0分?jǐn)?shù)顯著更高(P<0.001)。巨噬細(xì)胞M0的CIBERSORT分?jǐn)?shù)隨著腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)升高顯著增加(P<0.05)。此外,巨噬細(xì)胞M0水平與HCC患者的血管浸潤(rùn)顯著相關(guān)(P<0.01)。

圖6 不同臨床病理學(xué)特征的M0浸潤(rùn)程度比較

3 討論

腫瘤中高密度的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)幾乎是所有惡性腫瘤炎癥浸潤(rùn)的主要成分[17,18]。在募集到腫瘤部位的固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中,巨噬細(xì)胞特別豐富,并且存在于腫瘤進(jìn)展的各個(gè)階段。TAMs可分為M1和M2亞型,CD68是M1的生物標(biāo)記,CD163和CD206是M2的生物標(biāo)記[19,20]。

我們的結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞M0在HCC腫瘤中顯著浸潤(rùn),并與HCC患者的預(yù)后、晚期腫瘤分期和惡性表型相關(guān)。研究表明巨噬細(xì)胞對(duì)HCC生存預(yù)后無(wú)顯著預(yù)測(cè)價(jià)值[21]。與其非腫瘤區(qū)域相比,已觀察到HCC患者的腫瘤內(nèi)區(qū)域巨噬細(xì)胞減少[22]。Li等[14]研究顯示,巨噬細(xì)胞與HCC患者OS存在相關(guān)性,而對(duì)DFS無(wú)影響。Ding等[23]發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中的巨噬細(xì)胞密度是OS和DFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,而腫瘤周?chē)奘杉?xì)胞密度與HCC患者的OS和DFS均不相關(guān)。相反,也有報(bào)道稱(chēng)TAMs對(duì)HCC患者的OS和DFS具有保護(hù)作用[24]。一項(xiàng)薈萃分析表明,腫瘤內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞與OS之間關(guān)聯(lián)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而腫瘤周?chē)呙芏菴D68+巨噬細(xì)胞與HCC患者OS正相關(guān)[10]。CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量在瘤體較大、分化差的HCC患者中顯著增加[25]。而且,高CD163+巨噬細(xì)胞水平顯示預(yù)后不良,并與HCC患者的腫瘤結(jié)節(jié)和靜脈浸潤(rùn)增加相關(guān)[20]。高度浸潤(rùn)的CD206+巨噬細(xì)胞與HCC患者侵襲性腫瘤表型和較差OS顯著相關(guān)[21,26]。此外,TAMs可引發(fā)腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加,從而促進(jìn)HCC進(jìn)展[27]。巨噬細(xì)胞還具有免疫抑制作用,可在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中阻止自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊[18,28]?？紤]到目前的證據(jù),本研究認(rèn)為T(mén)AM亞型的異質(zhì)性及其起源和動(dòng)態(tài)表型在HCC發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中導(dǎo)致抗腫瘤或促腫瘤發(fā)生功能性差異[10,21,29-31]。

本研究表明,巨噬細(xì)胞M0促進(jìn)了侵襲性腫瘤表型,包括HCC患者血管侵犯、晚期腫瘤分期和AFP升高。TAMs對(duì)腫瘤血管化的調(diào)控有較大影響[18,32]。病理分析發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞有助于分化良好的HCC患者腫瘤血管形成[33]。已有的證據(jù)表明TAM計(jì)數(shù)與HCC患者腫瘤微血管相關(guān)[34]。Ding等[23]發(fā)現(xiàn)鄰近巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與血管侵犯相關(guān),但與腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度無(wú)關(guān)。巨噬細(xì)胞通過(guò)激活JAK2/STAT3/Snail通路以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[35]。CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量在腫瘤Ⅳ期的HCC患者中顯著增加[25]。基于既往研究證據(jù)和本研究結(jié)果,表明腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞加速了HCC的惡性腫瘤表型進(jìn)展。