響應(yīng)面法優(yōu)化苦膽草多糖脫色工藝

黃麗金 李自霖 陳貴元

摘要 為了確定過(guò)氧化氫法脫除苦膽草多糖中色素的最佳工藝，以多糖脫色率、多糖保留率2個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分為考查指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化過(guò)氧化氫法脫除苦膽草多糖中色素的工藝條件。結(jié)果表明，過(guò)氧化氫法色素最佳工藝為脫色溫度55 ℃，脫色時(shí)間209 min，過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)2.73%，脫色1次。在該工藝條件下脫除色素，得到多糖脫色率為72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評(píng)分為79.8，與預(yù)測(cè)值80.08相比，誤差為0.3%?；貧w方程與實(shí)際情況擬合較好，表明該脫色工藝穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞 苦膽草多糖；響應(yīng)面法；過(guò)氧化氫；脫色工藝

中圖分類(lèi)號(hào) R283? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）09-0157-05

Abstract To determine the best process of removing pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. Based on the single factor test， response surface method was used to optimize the process conditions for the removal of pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. The results showed that the optimal process of the hydrogen peroxide method was decolorization temperature 55 ℃， decolorization time 209 min， hydrogen peroxide volume fraction 2.73%， and decolorization once. Depigmentation under the process conditions， the depigmentation rate of polysaccharide was 72.43%， the retention rate of polysaccharide was 87.24%， and the comprehensive score was 79.8， compared with the theoretical 80.08， the error was 0.3%. The regression equation fits well with the actual situation， indicating that the decolorization process is stable and reliable.

Keywords Radix gentianae polysaccharide; response surface method; hydrogen peroxide; depigmentation process

苦膽草（Radix gentianae），別名穿心蓮，屬爵床科一年生藥用植物，性寒、味苦，具有清熱解毒、抗炎止痛等功效，全草均可入藥，是一種傳統(tǒng)的中藥植物資源[1]，廣泛分布于福建、廣東、云南等地區(qū)[2]?？嗄懖莺卸嗵?、黃酮、多酚、內(nèi)酯等多種活性成分[3-5]?？嗄懖荻嗵堑奶崛」に嚭蜕锘钚匝芯磕壳斑€鮮有報(bào)道[5-7]，苦膽草多糖脫色工藝的研究則尚未見(jiàn)報(bào)道。

多糖的提取方法眾多[8]，植物多糖多為水溶性分子，通常采用水作為溶劑進(jìn)行浸提，提取多糖的同時(shí)常將水溶性色素浸提出來(lái)?yè)Q入多糖中，使多糖顏色較深。色素的存在不僅干擾多糖的純度，還影響多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及生物活性等方面的研究[9]，因此有必要對(duì)多糖進(jìn)行脫色處理。多糖的脫色方法主要有過(guò)氧化氫法、活性碳法以及大孔樹(shù)脂等，不同的脫色方法對(duì)脫色率、多糖保留率乃至多糖活性都有影響[10-13]。植物多糖含有的色素物質(zhì)大多是水溶性的，且結(jié)構(gòu)多以負(fù)離子形式存在[14]。過(guò)氧化氫的水溶液能夠電離出過(guò)氧氫根離子，能夠氧化水溶性色素負(fù)離子達(dá)到脫色效果，且對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及活性破壞較小[15-16]?；诖耍狙芯繑M采用過(guò)氧化氫法脫除苦膽草多糖中的色素，響應(yīng)面法優(yōu)化脫色工藝，為苦膽草多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及生物活性的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦膽草購(gòu)于大理市中藥材市場(chǎng)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蒽酮、濃硫酸、30%過(guò)氧化氫均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 主要儀器

BT-224S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯儀器公司），恒溫水浴鍋（上海博迅達(dá)實(shí)業(yè)有限公司），B600型低速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），SP-722可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦膽草多糖的提取。工藝流程如下：苦膽草干粉→萃取回流→熱水浸提→濃縮→脫蛋白→乙醇沉淀→離心、洗滌→冷凍干燥→得到苦膽草多糖粗品。具體提取方法參考徐兵[7]文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。參照文獻(xiàn)[17]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL，得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)液，加去離子水補(bǔ)至2 mL，在冰水浴中每管加入4 mL 0.5%的蒽酮濃硫酸試劑，混勻，沸水浴中加熱10 min，室溫靜置10 min。在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為X軸，吸光度（A）為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.014 2X+0.011 5，R2=0.995 2，表明在0～0.06 mg/mL葡萄糖濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后續(xù)試驗(yàn)葡萄糖濃度測(cè)定。

1.3.3 脫色率的測(cè)定。精密稱(chēng)取0.6 g苦膽草多糖干粉，去離子水定溶至100 mL。取過(guò)濾多糖溶液使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，未得到合適的最大吸收峰值，由于溶液顏色為深褐色，按照溶液的互補(bǔ)色選取560 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[18]。過(guò)氧化氫對(duì)苦膽草多糖的脫色率按下列公式計(jì)算：

式中：D表示脫色率，%；A0為苦膽草多糖溶液過(guò)氧化氫脫色前在560 nm 處的吸光度；A1為苦膽草多糖溶液過(guò)氧化氫脫色后在560 nm處的吸光度。

1.3.4 多糖保留率的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[17]的方法，在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定吸光度，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖質(zhì)量濃度。代入下式計(jì)算多糖的保留率：

式中：R表示多糖保留率，%；C1為過(guò)氧化氫脫色后苦膽草多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；C0為過(guò)氧化氫脫色前苦膽草多糖質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.5 脫色效果評(píng)價(jià)。采用綜合加權(quán)評(píng)分法[19]評(píng)價(jià)苦膽草多糖的脫色效果，將多糖脫色率（D）和多糖保留率（R）兩者的權(quán)重值均設(shè)為50，總分計(jì)算為100分，其綜合評(píng)分按照下列公式計(jì)算：

式中：M表示多糖脫色率和多糖保留率的綜合評(píng)分，分；D表示脫色率，%；Dmax表示脫色率的最大值，%；R表示多糖保留率，%；Rmax表示多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 單因素試驗(yàn)。在固定脫色溫度50 ℃、脫色時(shí)間3 h、過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)3%、脫色1次的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察脫色溫度、脫色時(shí)間、過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素對(duì)多糖脫色率和保留率的影響。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取脫色溫度（A）、脫色時(shí)間（B）、過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)（C）為考察因素，以多糖脫色率和多糖保留率的綜合評(píng)分（Y）為考察指標(biāo)，采用3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化苦膽草多糖的脫色工藝。因素水平見(jiàn)表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Design Expert 10.0、Excel 2010、Origin 9.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 脫色溫度對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響。如圖1可知，在30～70 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖脫色率不斷增加，多糖保留率則不斷下降。可能是隨著溫度的升高，過(guò)氧化氫氧化色素的能力不斷增強(qiáng)，但是溫度過(guò)高可能會(huì)引起多糖水解，導(dǎo)致多糖損失較大。當(dāng)脫色溫度低于50 ℃時(shí)，多糖保留率較高，但脫色率低；當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃，脫色率急驟升高，但多糖保留率則顯著下降。在脫色溫度為50 ℃時(shí)，多糖脫色率為64.77%，多糖保留率為85.82%，兩者都得到兼顧，因此選擇50 ℃作為脫色溫度開(kāi)展后續(xù)單因素試驗(yàn)。綜合考慮，選擇脫色溫度40、50、60 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.2 過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響。由圖2可知，隨著過(guò)氧化氫用量的增加，脫色率不斷地增加，多糖保留率不斷下降，在過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)小于3%，脫色率大幅度增加，過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)大于3%之后多糖脫色率上升緩慢，可能是過(guò)氧化氫與色素的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。與此同時(shí)，隨著過(guò)氧化氫體積份數(shù)的增加，多糖保留率不斷降低，可能是過(guò)氧化氫的強(qiáng)氧化性破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖損失。在過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，多糖脫色率為67.73%，多糖保留率為83.39%。為避免多糖過(guò)多的損失以及保證脫色效果，選取過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)3%開(kāi)展后續(xù)單因素試驗(yàn)。綜合考慮，選擇過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)2%、3%、4%開(kāi)展響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.3 脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響。如圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率不斷增加，多糖保留率則不斷下降。脫色時(shí)間小于3 h，脫色率增加顯著，在超過(guò)3 h之后，脫色率增加趨緩。這可能是過(guò)氧化氫與色素分子的結(jié)合會(huì)出現(xiàn)飽和狀態(tài)，所以脫色一定時(shí)間后，脫色率就會(huì)逐漸趨緩。隨著過(guò)氧化氫脫色作用時(shí)間的增加，過(guò)氧化氫也會(huì)氧化破壞多糖分子，造成多糖損失。因此考慮時(shí)間成本以及多糖的保留率，選擇脫色時(shí)間為2、3、4 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。采用Design Expert 10.0軟件分析表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到綜合評(píng)分（Y）與脫色溫度（A）、脫色時(shí)間（B）、過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)（C）的相關(guān)性擬合方程：Y=77.93+4.76A+2.50B+0.30C+0.28AB+0.78AC+0.49BC-2.89A2-1.71B2-0.70C2。

由表3可知：該模型的P<0.01，表明該回歸方程極顯著，提示試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。失擬項(xiàng)P值為0.422 1 P>0.05，提示該回歸方程擬合度較好。脫色溫度（A）、脫色時(shí)間（B）以及脫色溫度的二次項(xiàng)（A2）對(duì)多糖脫色的綜合評(píng)分具有極顯著影響（P<0.01）；脫色時(shí)間的二次項(xiàng)（B2）對(duì)多糖脫色的綜合評(píng)分具有顯著影響（P<0.05），提示改變這些因素的條件會(huì)使響應(yīng)值（綜合評(píng)分）產(chǎn)生顯著變化?；貧w方程的交互項(xiàng)AB、AC、BC的P>0.05，表明各交互項(xiàng)對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著，提示3個(gè)因素?zé)o交互作用。

根據(jù)表3中F值的大小，提示各因素對(duì)響應(yīng)值（綜合評(píng)分）的影響強(qiáng)弱為脫色溫度（A）>脫色時(shí)間（B）>過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)（C）。其中脫色溫度對(duì)響應(yīng)值的影響最大。模型R2=0.968 6，R2Adj=0.928 2，均大于0.9，表明該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值較為接近，表明該模型能很好地模擬真實(shí)的試驗(yàn)過(guò)程。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)軟件Design-Expert 10.0預(yù)測(cè)的最優(yōu)脫色工藝條件為：脫色溫度54.63 ℃，脫色時(shí)間208.53 min，過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為2.73%。多糖脫色率的理論預(yù)測(cè)值為70.11%，多糖保留率為90.04，綜合評(píng)分為80.08。為了便于實(shí)際操作，將各因素修正為：脫色溫度55 ℃，脫色時(shí)間209 min，過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為2.73%，脫色1次。在該工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取均值，得到多糖脫色率為72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評(píng)分為79.84，與預(yù)測(cè)值80.08相比，誤差為0.3%，表明該脫色工藝穩(wěn)定可靠，可用于苦膽草多糖色素的脫除。

3 結(jié)論

過(guò)氧化氫方法脫色素具有操作簡(jiǎn)便、脫色率高的優(yōu)勢(shì)，適用于脫除帶負(fù)電荷的水溶性色素[14]。本研究通過(guò)過(guò)氧化氫法對(duì)苦膽草多糖進(jìn)行響應(yīng)面脫色試驗(yàn)，以多糖脫色率和多糖保留率2個(gè)指標(biāo)確定了單因素試驗(yàn)中脫色溫度、脫色時(shí)間、過(guò)氧化氫用量的最佳參數(shù)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化苦膽草多糖過(guò)氧化氫脫色工藝，得到最佳脫色工藝為：脫色溫度55 ℃，脫色時(shí)間209 min，過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為2.73%，脫色1次。在此條件下，多糖脫色率達(dá)到72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評(píng)分為79.8。表明該工藝穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)中苦膽草多糖色素的脫除。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860252）；云南省自然科學(xué)基金高校聯(lián)合面上項(xiàng)目（2017FH001-084）；云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（AG2022006）。

作者簡(jiǎn)介 黃麗金（1998—），女，福建上杭人，在讀碩士。研究方向：植物多糖分離提取及功能。