基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

戴菲菲 孔紅武 謝柏勝

[摘要]?目的?利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法?應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）、公共化合物數(shù)據(jù)庫（PubChem）、藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫（Swiss?Target?Prediction）及人類基因數(shù)據(jù)庫（the?Human?Gene?Database，GenCards）分別獲得藥物成分、藥物潛在靶點(diǎn)和肺癌相關(guān)靶點(diǎn)，將二者交集靶點(diǎn)通過String數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行藥物–疾病蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，進(jìn)而利用Cytoscape軟件篩選出關(guān)鍵藥物成分和核心靶點(diǎn)。通過Webgestalt數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行基因本體（gene?ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析；運(yùn)用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果?益氣補(bǔ)肺顆粒含有潛在活性成分129個(gè)，主要成分包括3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇。調(diào)節(jié)肺癌相關(guān)免疫功能的潛在靶點(diǎn)137個(gè)，核心靶點(diǎn)主要有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal?transduction?and?activator?of?transcription?3，STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（rac-alpha?serine/?threonine-protein?kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine?protein?kinase，TPK）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated?protein?kinase3，MAPK3）、熱休克蛋白90α家族A類成員1[heat?shock?protein?90-kDa?alpha（cytosolic），class?A?member?1，HSP90AA1]。GO富集分析結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化等有關(guān)；KEGG信號(hào)通路主要包括C型凝集素受體（c-type?lectin?receptor，CLR）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化等。分子對(duì)接結(jié)果顯示5個(gè)關(guān)鍵成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性。結(jié)論?益氣補(bǔ)肺顆粒可通過甘草、天冬、當(dāng)歸、人參中的多種活性成分、多靶點(diǎn)作用，并通過影響CLR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化等多通路起到提高肺癌患者免疫功能的作用。

[關(guān)鍵詞]?肺癌；免疫功能；益氣補(bǔ)肺顆粒；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

[中圖分類號(hào)]?R285??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.014

Study?on?the?immunomodulatory?mechanism?of?Yiqi?Bufei?granule?on?lung?cancer?based?on?network?pharmacology

DAI?Feifei，?KONG?Hongwu，?XIE?Baisheng

Department?of?Cardiothoracic?Surgery，?Hangzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?310007，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?Yiqi?Bufei?granule?in?regulating?immune?function?of?lung?cancer?by?network?pharmacology.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?（TCMSP），?PubChem，?Swiss?Target?Prediction?and?the?human?gene?database?（GenCards）?were?used?to?obtain?drug?components，?potential?drug?targets?and?lung?cancer?related?targets，?respectively.?The?intersection?targets?of?the?two?were?used?to?construct?drug-disease?protein?interaction?network?through?String?data?platform.?CytoScape?software?was?used?to?screen?out?key?drug?components?and?core?targets.?Gene?ontology（GO）?enrichment?analysis?and?Kyoto?Eencyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?pathway?analysis?were?analyzed?by?Webgestalt?data?platform.?Molecular?docking?was?performed?using?AutoDock.?Results?Yiqi?Bufei?granule?contained?129?potential?active?ingredients，?included?3-methoxy-glabridin，?glycyrol，?phaseol，?7-methoxy-2-methyl?isoflavone，?and?stigmasterol.?There?were?137?potential?targets?for?regulating?lung?cancer-related?immune?function，?and?the?core?targets?mainly?included?signal?transduction?and?activator?of?transcription?3?（STAT3），?proteinkinase?（AKT1），?tyrosine?protein?kinase（TPK），?mitogen-activated?protein?kinase3?（MAPK3）?and?heat?shock?protein?90-kDa?alpha?（cytosolic），?class?A?member?1?（HSP90AA1）.?GO?enrichment?analysis?showed?that?the?core?targets?were?mainly?related?to?inflammatory?response，?immune?system?regulation，?protein?phosphorylation，?etc.?KEGG?pathway?mainly?included?c-type?lectin?receptor?（CLR）?signaling?pathway，?vascular?endothelial?growth?factor?（VEGF）?signaling?pathway，?Th17?cell?differentiation?and?so?on.?The?results?of?molecular?docking?showed?that?the?five?key?components?had?good?binding?activities?with?the?five?core?targets.?Conclusion?Yiqi?Bufei?granule?may?have?multiple?active?ingredients?and?targets?in?licorice，?tiandong，?angelica，?ginseng，?and?may?also?improve?the?immune?function?of?lung?cancer?patients?by?affecting?multiple?pathways?such?as?CLR?signaling?pathway，?VEGF?signaling?pathway，?and?Th17?cell?differentiation.

[Key?words]?Lung?cancer;?Immune?function;?Yiqi?Bufei?granule;?Network?pharmacology;?Molecular?docking

肺癌是一種由遺傳和表觀遺傳畸變驅(qū)動(dòng)的疾病，在所有惡性腫瘤中，肺癌發(fā)病率和病死率位居前二[1-2]。傳統(tǒng)化療和放療可產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，如器官功能受損、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、耐藥及相關(guān)免疫功能下降[3-4]。中醫(yī)認(rèn)為治療肺癌應(yīng)祛除邪毒，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的治療策略一致。研究顯示，中醫(yī)藥對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫具有良好的調(diào)節(jié)作用，對(duì)減輕肺癌患者不良反應(yīng)和提高生存質(zhì)量有顯著效果[5-6]。中藥成分可通過不同途徑改變機(jī)體免疫功能，如槲皮素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)，有效控制腫瘤細(xì)胞的數(shù)量[7]。研究結(jié)果表明益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌患者免疫功能有良好的改善作用，國內(nèi)外研究均證實(shí)益氣補(bǔ)肺顆粒中的中藥成分黃芪、當(dāng)歸、人參、天冬、五味子、甘草對(duì)肺癌治療有一定療效[6，8-12]。中藥成分復(fù)雜，其藥理作用可通過不同途徑產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，但目前有關(guān)益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少。本研究在先前研究的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌患者免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，確定藥物的有效活性成分、作用靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，為臨床試驗(yàn)及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??益氣補(bǔ)肺顆粒有效活性成分及靶點(diǎn)獲取

益氣補(bǔ)肺顆粒由黃芪、當(dāng)歸、人參、天冬、五味子、甘草組成。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）對(duì)上述6種中藥的活性成分進(jìn)行篩選，以藥物生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)。通過公共化合物數(shù)據(jù)庫（PubChem）收集成分中化合物的結(jié)構(gòu)式，進(jìn)而利用藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫（Swiss?Target?Prediction）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲得藥物有效活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，最后刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到藥物作用靶點(diǎn)。

1.2??肺癌免疫功能靶點(diǎn)收集

通過人類基因數(shù)據(jù)庫（the?Human?Gene?Database，GenCards）搜索“l(fā)ung?cancer”和“immunity”，得到肺癌、免疫功能相關(guān)靶點(diǎn)，篩選標(biāo)準(zhǔn)以相關(guān)度值（relevance?score）>8倍中位數(shù)值。

1.3??益氣補(bǔ)肺顆粒調(diào)節(jié)肺癌免疫功能作用靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述益氣補(bǔ)肺顆粒調(diào)節(jié)肺癌免疫功能的中藥及其有效活性成分、靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)通過Cytoscape軟件，構(gòu)建藥物–活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算各個(gè)中心度值、節(jié)點(diǎn)度值，篩選核心活性成分。

1.4??構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將益氣補(bǔ)肺顆粒和肺癌的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)平臺(tái)，蛋白質(zhì)參數(shù)設(shè)置為“multiple?proteins”，物種參數(shù)設(shè)置為“Homo?sapiens”，交互評(píng)分最小值設(shè)置為0.7，隱藏離散靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。下載PPI文件并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，分析結(jié)果包括中心度值、節(jié)點(diǎn)度值，用于核心靶點(diǎn)篩選。

1.5??GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用Webgestalt數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)益氣補(bǔ)肺顆粒和肺癌交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene?ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）信號(hào)通路分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)獲得有差異的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能及信號(hào)通路信息。

1.6??分子對(duì)接

從TCMSP數(shù)據(jù)平臺(tái)下載核心活性成分的3D結(jié)構(gòu)作為分子對(duì)接的配體小分子；使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果由Open?Babel軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，最后通過PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。

2??結(jié)果

2.1??益氣補(bǔ)肺顆?；钚猿煞旨白饔冒悬c(diǎn)

篩選得到158個(gè)活性成分，其中黃芪20個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、人參22個(gè)、天冬9個(gè)、五味子13個(gè)、甘草92個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后得到129個(gè)有效活性成分，其中共有活性成分11個(gè)。Swiss?Target?Prediction靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分別得到黃芪690個(gè)、當(dāng)歸115個(gè)、人參611個(gè)、天冬326個(gè)、五味子497個(gè)、甘草965個(gè)，刪除作用靶點(diǎn)中的重復(fù)項(xiàng)，最終獲得1239個(gè)益氣補(bǔ)肺顆?；钚猿煞謱?duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，見表1。

2.2??益氣補(bǔ)肺顆粒-肺癌-免疫功能相關(guān)靶點(diǎn)

通過GenCards獲取肺癌基因和免疫功能基因，篩選后獲得肺癌相關(guān)基因1319個(gè)，免疫功能基因1081個(gè)，藥物–疾病–免疫功能交集靶點(diǎn)137個(gè)。

2.3??藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

有效活性成分、作用靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的藥物數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建顯示，共有272個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括6個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、129個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和137個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，2917條交互作用關(guān)系，見表2。節(jié)點(diǎn)度值排名前5的活性成分分別為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇。

2.4??蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共有137個(gè)節(jié)點(diǎn)、1546條互作關(guān)系，通過CytoHubba插件計(jì)算獲得節(jié)點(diǎn)中心度值、節(jié)點(diǎn)度值。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值進(jìn)行排序，前20為核心網(wǎng)絡(luò)，其中前5名分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal?transduction?and?activator?of?transcription?3，STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（rac-alpha?serine/threonine-protein?kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine?protein?kinase，TPK）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated?protein?kinase3，MAPK3）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat?shock?protein?90-kDa?alpha（cytosolic），class?A?member?1，HSP90AA1）。

2.5??GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析獲得生物過程1923條、細(xì)胞組成103條及分子功能168條。按照校正P<0.01篩選，將排名前20的條目進(jìn)行氣泡圖繪制。益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌免疫調(diào)節(jié)的生物過程主要為炎癥反應(yīng)、激活免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)正向調(diào)節(jié)、對(duì)外部刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、白細(xì)胞活化；細(xì)胞成分主要與膜筏、膜微區(qū)、受體復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、囊泡腔、胞質(zhì)囊泡腔等密切相關(guān)；分子功能涉及STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等。

KEGG富集分析共得到187個(gè)信號(hào)通路，以P<0.05篩選排名前20的通路繪制富集條形圖，如C型凝集素受體（c-type?lectin?receptor，CLR）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol?3?kinase/protein?kinase?B，PI3K/AKT）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated?protein?kinase，MAPK）信號(hào)通路等，見圖1。

2.6??分子對(duì)接

結(jié)合能<–5kal/mol表明蛋白分子與配體小分子有較好的結(jié)合能力，本研究篩選5種關(guān)鍵成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接見表3。選擇中心度值最高的STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1與5種關(guān)鍵活性成分構(gòu)建的分子對(duì)接模式見圖2。

3??討論

本研究結(jié)果表明，益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌免疫調(diào)節(jié)的主要有效活性成分為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇，主要存在于甘草、天冬、當(dāng)歸、人參4味中藥。同時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在靶點(diǎn)137個(gè)，通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是肺癌免疫調(diào)節(jié)的核心靶點(diǎn)。

益氣補(bǔ)肺顆粒組方中的黃芪、甘草、人參屬補(bǔ)益類中藥，所含多種黃酮類、酚類和查爾酮類可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增加機(jī)體免疫功能；天冬、當(dāng)歸所含活性成分具有潤肺止咳、養(yǎng)血補(bǔ)血的作用[9]。全方奏補(bǔ)脾益肺、養(yǎng)陰潤燥、補(bǔ)血活血之效。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益氣補(bǔ)肺顆粒中的活性成分-3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇在肺癌免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。3-甲氧基光甘草定、甘草酚屬異黃酮類化合物，是甘草的主要成分，通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力、

抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)抗癌先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13-15]。Lu等[16]發(fā)現(xiàn)健脾復(fù)方配方中，菜豆醇是主要活性成分之一，可通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白傳導(dǎo)相關(guān)基因和蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，7-甲氧基-2-甲基異黃酮可通過下調(diào)白細(xì)胞介素-6基因表達(dá)水平發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[17]，與本研究結(jié)果類似。豆甾醇可通過調(diào)控MAPK3蛋白表達(dá)、雌激素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[18]。

STAT3、AKT1、TPK是肺癌組織的標(biāo)志物，是肺癌靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究分析表明，STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是調(diào)節(jié)肺癌免疫功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與前述結(jié)果基本一致[19-24]。通過抑制TPK表達(dá)可阻斷AKT信號(hào)通路，而AKT1是P13K/AKT、PERK/eIF2α信號(hào)通路的樞紐，進(jìn)而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制肺癌的發(fā)展[19-21]。MAPK3是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular?signal-regulatedkinase，ERK）家族的一員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和生長周期[22]。作為一種伴侶蛋白，HSP90AA1敲低可抑制AKT1和ERK激活，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，并抑制肺癌細(xì)胞增殖[23]。

KEGG分析結(jié)果顯示，益氣補(bǔ)肺顆粒主要通過CLR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其中CLR信號(hào)通路腫瘤免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，激活CLR可增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬作用，有效提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[24]；VEGF信號(hào)通路在血管生成過程中發(fā)揮不可替代的作用；Mu等[25]發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白2（calmodulin2，CALM2）通過調(diào)控VEGF等信號(hào)通路，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移；Th17細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)和宿主防御至關(guān)重要，通過分泌白細(xì)胞介素-17對(duì)抗細(xì)胞外的細(xì)菌及霉菌[26-28]。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討益氣補(bǔ)肺顆粒對(duì)肺癌的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，確定藥物關(guān)鍵成分為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮和豆甾醇，可通過CLR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等作用于STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等靶點(diǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

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