李果實性狀指標(biāo)相關(guān)性分析及QTL 初步定位

孫莉莉，彭麗娜，牟蘊慧，葉萬軍

（1.哈爾濱體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086）

【研究意義】李（Prunus salicinaL.）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，李在我國分布廣泛，幾乎所有省份都有栽培［1］，位于我國東北地區(qū)的黑龍江省依托寒地優(yōu)勢，抗寒種質(zhì)資源豐富，為抗寒新品種的選育提供了較好的種質(zhì)來源。由于李富含糖、酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的抗氧化活性，其中提取出的活性肽能有效抵抗自由基［2］，同時李可鮮食，也可進行深加工［3］，深加工后的產(chǎn)品價值提升，能有效帶動當(dāng)?shù)亟?jīng)濟，具有較高的經(jīng)濟價值?！厩叭搜芯窟M展】數(shù)量性狀位點（Quantitative Trait Locus，QTL）定位是研究數(shù)量性狀的一種有效方法，構(gòu)建高密度遺傳圖譜是QTL 定位的基礎(chǔ)，果樹受童期長、純合與雜合位點共存、遺傳背景復(fù)雜等因素的影響，獲得高密度遺傳圖譜較難，容易影響果樹QTL 定位的準(zhǔn)確性［4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，果樹果實性狀QTL 定位研究也有一定的進展。果實品質(zhì)是新品種選育的重要依據(jù)，果實品質(zhì)包括內(nèi)在品質(zhì)和外觀品質(zhì)，內(nèi)在品質(zhì)體現(xiàn)在果實可溶性固形物、維生素C、可滴定酸及酚類化合物等含量。針對桃﹝Prunus persica（L.）Batsch﹞果實品質(zhì)性狀的研究比較深入，Shi等［5］基于SLAF-Seq 構(gòu)建了桃高密度遺傳圖譜，對果實質(zhì)量、果實橫徑等12 個果實性狀進行QTL 定位，獲得90 個位點，同時篩選和鑒定了果實性狀的候選基因；張瑞萍等［6］對梨（PyrusL.）的單果質(zhì)量、果實橫徑、果實縱徑和縱徑橫徑比等果實性狀進行了研究，結(jié)果共獲得QTL 位點8 個，定位在不同的連鎖群上，LOD 值在2.50～4.14 之間，可解釋11.4%～36.4%的表型變異。研究發(fā)現(xiàn)，在連鎖群3 上有3 個柑橘（CitrusL.）果實橫徑QT L位點，在連鎖群8 上有4 個果實縱徑QTL 位點［7］。近年，唐海霞等［8］對棗（Ziziphus jujubaMill.）果實性狀的QTL 定位進行了報道，共檢測到156 個棗果實相關(guān)的QTL 位點，分布在10 個連鎖群中。郭棟梁等［9］報道了龍眼（Dimocarpus longanLour.）種質(zhì)資源果實性狀的多樣性及相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單果質(zhì)量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。徐豆等［10］對歐李﹝Cerasus humilis（Bge.）Sok.﹞親本及正反交F1后代果實性狀的遺傳變異進行分析，研究表明雜交后代單果質(zhì)量、可溶性固形物含量、果形指數(shù)等屬于數(shù)量性狀，由多基因控制。孫海龍等［11］對35 份李種質(zhì)的果實性狀進行18個指標(biāo)的相關(guān)性分析，為李種質(zhì)資源品質(zhì)性狀的評價提供理論基礎(chǔ)。然而，國內(nèi)關(guān)于寒地李果實性狀QTL 定位研究較少。【本研究切入點】鑒于李具有的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，本試驗以東北地區(qū)李吉林6 號（P.salicinacv.jilin6）和龍園秋李（P.salicinacv.longyuanqiuli）的F1子代為研究群體，在已構(gòu)建遺傳圖譜基礎(chǔ)上［12］，對單果質(zhì)量、果實橫徑、果實縱徑、果形指數(shù)、果肉厚度和總糖含量6 個果實性狀進行相關(guān)性分析和QTL 的初步定位?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過本研究，對李部分果實性狀進行QTL 初步定位，為寒地李分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為吉林6 號和龍園秋李的72 株F1子代植株，親本在2009 年進行雜交授粉，雜交種子于2010 年播種、2012 年定植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院核果試驗園，長勢較好，按照常規(guī)田間管理模式進行管理，子代沒有進行剔選。2017 年秋季部分植株果實成熟后，采集果實進行果實相關(guān)性狀的統(tǒng)計和測量，果實采集時選擇樹齡、株型、生長勢、載果量一致的正常株，從每株的全部收獲物中選取大中小和向陽和背陰的果實組成平均樣品。測試地點在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 測量方法 通過電子天平（精度為0.01 g，浙江托普儀器有限公司）對單果質(zhì)量（Weight of single fruit，WSF）進行稱量；使用游標(biāo)卡尺（精度為0.01 mm）對果實橫徑（Transverse diameter of fruit，TDF）、果實縱徑（Vertical diameter of fruit，VDF）、果肉厚度（Thickness of pulp，TP）等指標(biāo)進行測量，測量標(biāo)準(zhǔn)參考郁香荷等［13］方法；通過棱鏡折射儀（精度為0.2%，廣州銘睿電子LB32T 糖度計）對總糖含量（Content of total sugar，CTS）進行測定；每個F1子代選擇3～5 個果實對各項指標(biāo)進行測量，同時計算果形指數(shù)（Fruit shape index，F(xiàn)I），果形指數(shù)=果實縱徑/果實橫徑。

1.2.2 統(tǒng)計方法 利用SPSS 23.0 軟件對果實性狀測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲得各項指標(biāo)的平均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、偏度和峰度，計算變異系數(shù)（變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值），根據(jù)正態(tài)性檢驗輸出結(jié)果分析各項指標(biāo)是否屬于正態(tài)分布。通過SPSS 23.0 繪制果實性狀各項指標(biāo)的頻率分布直方圖，同時對各指標(biāo)的相關(guān)性進行分析。

1.2.3 QTL 定位分析 本研究基于已經(jīng)構(gòu)建的李遺傳連鎖圖譜［12］，通過Map QTL 5.0 軟件將正態(tài)性分布的性狀進行QTL 分析，在Map QTL 5.0軟件中，依據(jù)置換檢驗（Permutation test）（次數(shù)>1 000）計算LOD 閾值，根據(jù)區(qū)間作圖法進行QTL 定位，最后利用Map Chart 2.3 軟件對獲得的QTL所在連鎖群進行繪圖。采用“果實性狀+數(shù)字”的方式命名QTL，如“TDF-1”表示“果實橫徑在連鎖群上的第1 個QTL”，若該果實性狀有多個位點，則數(shù)字順延。

2 結(jié)果與分析

2.1 李F1 群體果實性狀的表型分析

李F1群體果實性狀表型分析結(jié)果如表1所示。果實單果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.537、方差為90.951，數(shù)值均較大，偏度和峰度均大于1，表明單果質(zhì)量的數(shù)據(jù)分布不對稱，果實個體之間存在較大差異。果實性狀的變異系數(shù)在6.09%～35.98%，各果實性狀變異較大，表明分離比較明顯。本研究測量果實總數(shù)量大于50 個，根據(jù)K-S 檢驗所得數(shù)據(jù)，若P>0.05，表明該指標(biāo)呈正態(tài)分布。如表1 中，果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度的K-S 檢驗結(jié)果均為P>0.05，表明其均呈正態(tài)分布，單果質(zhì)量、果形指數(shù)和總糖含量的K-S 檢驗值均小于0.05，表明數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布。各果實性狀分布情況見圖1，該圖同時顯示了各指標(biāo)的頻率分布直方圖，直方圖中正態(tài)分布曲線也顯示了各指標(biāo)的正態(tài)分布情況。

圖1 李F1 群體果實性狀的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of fruit traits in F1 population of plum

表1 李F1 群體果實性狀的表型分析Table 1 Phenotypic analysis of fruit traits in F1 population of plum

2.2 李F1 群體果實性狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 23.0 軟件對李F1群體果實性狀的相關(guān)性進行分析，結(jié)果如表2 所示，果實單果質(zhì)量與果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度均具有極顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)最大的是單果質(zhì)量與果實橫徑，r為0.959，表明單果質(zhì)量與果實橫徑關(guān)系最密切，篩選較大單果質(zhì)量果實的同時，果實橫徑也會隨之升高；單果質(zhì)量與果形指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與總糖含量具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明單果質(zhì)量越大，果形指數(shù)和總糖含量越小，選擇單果質(zhì)量大、同時果形指數(shù)大和總糖含量高的品種比較難。果實橫徑與果實縱徑、果肉厚度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明果實橫徑與果實縱徑、果肉厚度關(guān)系最密切，在連鎖群上的QTL 分布可能也較近；果實橫徑與果形指數(shù)、總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，r分別為-0.548 和-0.233，這一變化趨勢和單果質(zhì)量與果形指數(shù)、總糖含量的關(guān)系相似，更進一步說明單果質(zhì)量與果實橫徑的關(guān)系最密切。果實總糖含量與其他指標(biāo)間存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，表明果實總糖含量在馴化過程中過分注重果實的大小，從而可能導(dǎo)致與果實總糖含量相關(guān)基因的丟失。

表2 李F1 群體果實性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of fruit traits in F1 population of plum

2.3 李F1 群體果實性狀的QTL 定位

利用吉林6 號和龍園秋李的F1子代構(gòu)建李的遺傳連鎖圖譜［12］，選用Map QTL 5.0 軟件對呈正態(tài)性分布的李果實性狀進行QTL 分析，依據(jù)置換檢驗確定各個性狀的LOD閾值（0.95和0.99水平），最終獲得果實性狀相關(guān)11個QTL位點（圖2、表3）。

圖2 李F1 群體果實性狀QTL 在連鎖圖譜上的分布Fig.2 Distribution of QTL for fruit traits in F1 population of plum on linkage map

表3 李F1 群體果實性狀的QTL 分析Table 3 QTL analysis of fruit traits in F1 population of plum

果實橫徑共獲得4 個QTL 位點，位點TDF-1位于第2 連鎖群7 cM 區(qū)域，LOD 值為2.91，表型變異解釋率為12.6%；位點TDF-2 位于第3連鎖群1 cM 區(qū)域，LOD 值為2.46，表型變異解釋率為9.8%；位點TDF-3 位于第8 連鎖群33 cM 區(qū)域，LOD 值為3.58，表型變異解釋率為14.4%；位點TDF-4 位于第15 連鎖群11 cM 區(qū)域，LOD 值為2.99，表型變異解釋率為13.6%。

果實縱徑共獲得4 個QT L位點，分別為VDF-1、VDF-2、VDF-3 和VDF-4，位點位置與果實橫徑連鎖群一致，分別位于第2、第3、第8 和第15 連鎖群，在連鎖群上的區(qū)域分別為8 cM、0 cM、35.535 cM 和18.272 cM，LOD 值分別為3.19、2.79、2.66 和2.91，能分別解釋12.7%、11.3%、10.4%和12.6%的表型變異。

果肉厚度共獲得3 個QTL 位點，分別為TP-1、TP-2 和TP-3，分別位于第2、第3 和第15 連鎖群，在連鎖群上的區(qū)域分別為4 cM、3 cM 和18.272 cM，LOD 值分別為2.71、3.46 和3.28，能分別解釋10.8%、14.3%和12.9%的表型變異。

3 討論

果樹具有基因高度雜合、自交不親和及育種周期長等特點，致使果樹遺傳圖譜構(gòu)建比較困難，這也制約了果樹QTL 定位研究的進程。關(guān)于果樹果實性狀的QTL 研究主要集中在桃、櫻桃（Prunus aviumL.）等物種上，關(guān)于李的研究較少。本研究中，李果實性狀變異系數(shù)在6.09%～35.98%，個體間變異較大，表明各果實性狀分離得比較明顯，其中單果質(zhì)量與果肉厚度之間的變異系數(shù)均大于19%。唐海霞等［8］以冬棗×金絲4 號的103 株F1群體為試驗材料，采用GBS 簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)SNP 分子標(biāo)記，參考冬棗全基因組篩選標(biāo)記，構(gòu)建棗高密度遺傳圖譜，對F1群體進行果實性狀的相關(guān)性分析和QTL 定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單果質(zhì)量的變異系數(shù)為19.49%；徐豆等［10］在歐李果實性狀遺傳變異研究中發(fā)現(xiàn)，單果質(zhì)量的變異系數(shù)大于20%。以上研究結(jié)果與本研究相似，表明單果質(zhì)量的個體差異在果實子代中普遍較大，出現(xiàn)廣泛分離。單果質(zhì)量屬于數(shù)量性狀，通常由多個基因控制，且易受外界環(huán)境影響，可能是群體中出現(xiàn)廣泛分離的原因［14］。

本研究中，李果實的單果質(zhì)量和總糖含量指標(biāo)呈非正態(tài)分布，所以沒有對其進行QTL 定位分析，僅對果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度進行了分析。根據(jù)已有研究結(jié)果，并未發(fā)現(xiàn)果實橫徑和果實縱徑的QTL 定位與連鎖群之間有很強的關(guān)聯(lián)。如Quilot等［15］在LG1、LG4、LG5、LG6 和LG7 上定位了不同的桃果核橫徑QTL，而Cantín等［16］在LG4 上定位了不同的桃果實橫徑QTL。在櫻桃中，Zhang等［17］在LG2 和LG6 中發(fā)現(xiàn)了果實橫徑QTL 位點；Rosyara等［18］在LG1、LG3 和LG6 中確定了6 個影響果實橫徑和縱徑的QTL。Campoy等［19］定位了LG5 中與甜櫻桃果實橫徑和縱徑控制相關(guān)的主要QTL，并沿著QTL 區(qū)間鑒定了不同的候選基因。本研究共獲得11 個QTLs 位點，其中果實橫徑和果實縱徑主要集中在LG2、LG3、LG8 和LG15 上，這與上述研究結(jié)果既有相似之處、也有不同結(jié)果，具體原因有待進一步深入研究。

本研究中，果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度定位在4 個連鎖群上，平均每個連鎖群定位2～3個位點，且各位點間距離較近，這與趙慧［20］關(guān)于甜櫻桃相關(guān)QTL 位點的結(jié)果相似，其甜櫻桃的單果質(zhì)量、細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞體積定位在同一條染色體上，且距離較近。QTL 在連鎖群上普遍存在成簇聚集的現(xiàn)象，這可能與果實性狀之間的相關(guān)性呈顯著水平有關(guān)，也可能與同一基因同時控制不同果實性狀有關(guān)。

本研究仍存在不足之處，首先，由于果樹具有自交不親和的特點，遺傳圖譜構(gòu)建只能以F1群體為作圖群體，這制約了高質(zhì)量遺傳圖譜的構(gòu)建，直接影響QTL 定位的準(zhǔn)確度。其次，黑龍江省位于我國東北部，春季倒春寒和冬季嚴(yán)寒氣候，導(dǎo)致F1群體數(shù)量過少，可能使QTL 定位出現(xiàn)偏差。第三，由于數(shù)量性狀受多基因的調(diào)控，且基因之間還存在著互作效應(yīng)，遺傳機制比較復(fù)雜，同時還受環(huán)境因素、群體大小及遺傳圖譜飽和度的影響，容易造成QTL 定位存在誤差。在將來應(yīng)考慮構(gòu)建多種標(biāo)記整合的圖譜，提高圖譜的飽和性和通用性，進而提高QTL 定位的準(zhǔn)確度，為挖掘李優(yōu)質(zhì)果實品質(zhì)基因奠定基礎(chǔ)，為培育李優(yōu)質(zhì)抗寒新品種提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以東北地區(qū)李吉林6 號和龍園秋李F1群體為試驗材料，對果實的單果質(zhì)量、果實橫徑、果實縱徑、果形指數(shù)、果肉厚度和總糖含量等6個果實性狀進行研究。表型分析結(jié)果顯示，單果質(zhì)量的變異系數(shù)為35.98%，表明F1群體間單果質(zhì)量分離得比較明顯；K-S 檢驗結(jié)果顯示，果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度的表型數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)正態(tài)分布；通過各指標(biāo)的相關(guān)性分析，單果質(zhì)量與果實橫徑呈極顯著正相關(guān)、相關(guān)系數(shù)為0.959，果實橫徑與果實縱徑、果肉厚度之間亦具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；QTL 定位共檢測到11 個QTL 相關(guān)位點，分別位于LG2、LG3、LG8 和LG15 連鎖群上，各位點在連鎖群上成簇分布，這可能與果實橫徑、果實縱徑和果肉厚度間存在極顯著正相關(guān)有關(guān)，LOD 值介于2.46～3.58，可解釋9.8%～14.4%的表型變異。