副豬格拉菌血清2 型毒力及耐藥性分析

王治方，徐引弟，朱文豪，焦文強(qiáng)，張青嫻，李海利，許 峰，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

【研究意義】副豬格拉菌（Glaesserella parasuis，GPS），原名副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS），是一種革蘭氏陰性、長(zhǎng)短不一的多形態(tài)細(xì)小桿菌，屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，是引起豬革拉澤氏病的病原體［1-2］。GPS 在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，可長(zhǎng)期定殖于健康豬的上呼吸道，一般情況下不引起豬只發(fā)病，但當(dāng)斷奶、轉(zhuǎn)群等應(yīng)激因素導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低時(shí)，可作為原發(fā)病原或繼發(fā)病原感染任何年齡、品種的豬，臨床發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%以上。發(fā)病豬群主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、四肢末端發(fā)紺、跛行、呼吸困難、顫抖、共濟(jì)失調(diào)等；典型病例的剖檢變化主要在腹膜、心包膜、胸膜，或關(guān)節(jié)面出現(xiàn)漿液-纖維素性或纖維素性化膿性炎癥，胸腔、腹腔和心包積液增多，嚴(yán)重時(shí)可形成“絨毛心”，已成為當(dāng)前養(yǎng)豬場(chǎng)最常見的細(xì)菌性病原之一［3-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】GPS 血清型較多，不同國(guó)家或地區(qū)的流行菌株血清型不同，菌株致病力和臨床表現(xiàn)也不盡相同。菌株毒力與血清型有較大關(guān)聯(lián)，普遍認(rèn)為血清1、5、10、12、13、14 型為高毒力菌株，血清2、4、15 為中等毒力菌株；血清3、6、7、8、9、11 型為無毒力菌株［6-7］。但近年來也有研究表明，GPS 臨床菌株毒力與血清型并不完全相關(guān)，同一血清型不同菌株的毒力不同甚至存在明顯差異。不同地區(qū)GPS 臨床菌株耐藥表型不同，同一地區(qū)菌株耐藥性也呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，大都表現(xiàn)出耐藥增強(qiáng)趨勢(shì)，導(dǎo)致GPS臨床防控更加復(fù)雜［8-9］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)GPS 血清2 型的報(bào)道較少，在河南地區(qū)的報(bào)道更少，而本實(shí)驗(yàn)室近年來不時(shí)從臨床病例中分離到GPS 血清2 型，表明血清2型的危害越來越嚴(yán)重?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對(duì)河南省焦作某規(guī)?；i場(chǎng)的疑似GPS 病例進(jìn)行細(xì)菌病原分離培養(yǎng)、純化，獲得1 株可疑病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、PCR 鑒定、分型，證實(shí)該菌株為豬GPS 血清2 型；同時(shí)對(duì)該分離菌株的致病性、耐藥性、毒力基因和耐藥基因攜帶等部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為GPS 的臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 病料來源于2022 年7 月河南省焦作某規(guī)?；i場(chǎng)保育豬群臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、消瘦、被毛粗亂、喘氣、部分豬關(guān)節(jié)腫大、跛行等癥狀的疑似病例，剖檢癥狀典型的病豬，采集肺臟、肝臟、氣管、心血和關(guān)節(jié)液等病料。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB），購(gòu)自美國(guó)BD Difco 公司；細(xì)菌總DNA 提取試劑盒、新生牛血清，購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ，NAD），購(gòu)自Hoffmann-La Roche 有限責(zé)任公司；革蘭氏染液試劑盒，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTMMix 等PCR 試劑，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；相關(guān)引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 10 只體質(zhì)量250 g 左右的健康豚鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離、純化 將無菌采集的發(fā)病豬氣管、肺臟、心血等病料，分別接種于TSA平板（含5%新生牛血清、0.001% NAD）上，37 ℃培養(yǎng)24～36 h；挑選無色透明針尖狀可疑菌落于TSA 平板上劃線培養(yǎng)純化，37 ℃培養(yǎng)24～36 h；挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢，通過掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)；分離菌于10 mL TSB（含5%新生牛血清、0.001% NAD）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，6 000 r/min離心5 min，PBS 洗脫3 次，用1.5 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定4 h 以上，送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.2 菌株鑒定和分型 參照文獻(xiàn)［10-12］設(shè)計(jì)擴(kuò) 增GPS 16S rRNA 基因和GPS 血清2型wzx基因的特異性引物（表1）。挑取分離菌株于37 ℃培養(yǎng)30 h 的培養(yǎng)物，按照DNA 提取試劑盒說明書提取菌株DNA，用16S rRNA 基因特異性引物和wzx基因引物對(duì)分離株DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定和分型。PCR 擴(kuò)增體系25 μL：2×Premix TaqTMMix13 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min、退火（退火溫度見表1）1 min、72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果?；厥誔CR陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

表1 菌株鑒定及分型的引物信息Table 1 Primers information of strain identification and typing

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［13-14］設(shè)計(jì)擴(kuò)增GPS 部分毒力基因的引物（表2），以分離菌株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)分離菌株毒力基因攜帶情況，PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參照1.2.2。

表2 毒力基因檢測(cè)的引物信息Table 2 Primers information of virulence genes detecting

1.2.4 致病性試驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5 只。將分離菌株接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h 后測(cè)定菌體濃度，連續(xù)10 倍稀釋，選取合適滴度涂布TSA 固體平板，每個(gè)滴度3 個(gè)平板，每個(gè)平板100 μL，37 ℃培養(yǎng)36 h 后活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算原液菌體濃度，調(diào)整菌體濃度至1×109CFU/mL 備用。試驗(yàn)組豚鼠腹腔注射菌液1 mL/只；對(duì)照組豚鼠腹腔注射生理鹽水1 mL/只。觀察記錄每組發(fā)病情況，連續(xù)觀察5 d，對(duì)發(fā)病死亡豚鼠進(jìn)行病理解剖、細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B 法）［15］，將分離菌株接種于TSA 培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)30 h 后挑取菌落，用滅菌PBS 液調(diào)整成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，用滅菌棉拭子將菌懸液均勻涂于TSA 平板表面，挑取臨床上常用的抗生素藥敏片均勻貼于涂有菌液的平板上，37 ℃培養(yǎng)36 h 后測(cè)量、記錄藥敏片抑菌圈直徑，結(jié)果判斷方法參照藥敏片說明書。

1.2.6 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［16-17］設(shè)計(jì)引物（表3），擴(kuò)增β 內(nèi)酰胺類（blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1）、氨基糖甙類〔aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1〕、四環(huán)素類〔tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G)〕、喹諾酮類（gyrA、parC）和磺胺類（sul1、sul2、sul3）的耐藥基因。以分離菌株DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)分離菌株攜帶耐藥基因情況，PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參照1.2.2。

表3 耐藥基因檢測(cè)的引物信息Table3 Primers information of drug-resistant genes detecting

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)純化結(jié)果

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、純化，在豬肺臟組織樣品中分離獲得1 株疑似副豬格拉菌。該株細(xì)菌生長(zhǎng)較緩慢，培養(yǎng)30 h 后的菌落針尖大小，形態(tài)明顯，呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，半透明、略帶藍(lán)色熒光；接種于不含NAD 的TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)均不能生長(zhǎng)。挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，該菌株為革蘭氏陰性球桿狀、短桿狀，有少量長(zhǎng)絲狀等多形態(tài)菌體（圖1A）；掃描電鏡下，菌體表面粗糙，呈短繩狀（圖1B）。

圖1 副豬格拉菌形態(tài)Fig.1 Morphology of Glaesserella parasuis

2.2 菌株鑒定和血清型檢測(cè)結(jié)果

通過PCR 擴(kuò)增鑒定，分離菌株擴(kuò)增出大小分別為1 090、295 bp 的產(chǎn)物帶（圖2），條帶和GPS、血清2 型目的條帶大小一致。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果利用BLAST 軟件進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，該菌株與GPS 2 型CL120103 菌株（CP020085.1）的同源性為100%，證明分離的菌株為副豬格拉菌，血清型為2 型，暫命名為HN1553。

圖2 菌株血清型PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification and typing of strains by PCR

2.3 毒力基因測(cè)定結(jié)果

PCR 擴(kuò)增檢測(cè)HN1553 菌株的毒力基因，結(jié)果（圖3）顯示，vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2 毒力基因?yàn)殛栃浴?/p>

圖3 副豬格拉菌毒力基因PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR results of virulence genes of Glaesserella parasuis

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

注射菌液3 h 后，試驗(yàn)組的5 只豚鼠先后出現(xiàn)食欲減退、被毛蓬亂、蜷縮扎堆、顫抖等癥狀；攻毒18～36 h，豚鼠先后死亡4 只。對(duì)死亡豚鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)胸腔、腹腔少量積液，腹腔粘膜有新鮮出血斑點(diǎn)（圖4A），肝臟、脾臟有少量纖維性滲出物附著（圖4B）。用腹水、心血、肝臟、脾臟觸片，革蘭氏染色鏡檢均發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性細(xì)小桿菌（圖5）。無菌采集死亡豚鼠的心血、肝臟、脾臟、腹水、腦分別接種TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)30 h 后，培養(yǎng)基平板均長(zhǎng)出均一的針尖大小菌落，經(jīng)鑒定均為GPS 血清2 型。試驗(yàn)組未死亡的發(fā)病豚鼠攻毒72 h 后，被毛粗亂、扎堆等癥狀減輕，食欲好轉(zhuǎn)；攻毒5 d 后，癥狀消失，剖檢豚鼠發(fā)現(xiàn)腹腔粘膜有少量陳舊性出血，肝臟、脾臟、腹腔有少量纖維素性滲出物，脾臟腫大；采集心血、肝臟、脾臟分別接種TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)48 h 均未見細(xì)菌生長(zhǎng)。試驗(yàn)期間，對(duì)照組豚鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

圖4 死亡豚鼠剖檢癥狀Fig.4 Necropsy symptoms of dead cavy

圖5 肝臟的副豬格拉菌形態(tài)Fig.5 Morphology of Glaesserella parasuis in liver

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，菌株HN1553對(duì)頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星敏感；對(duì)新霉素、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星的敏感性處于敏感和耐藥之間；對(duì)青霉素G、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)耐藥。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Drug sensitivity test results

2.6 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

PCR 擴(kuò)增檢測(cè)HN1553 菌株的耐藥基因，結(jié)果（圖6）顯示，aadA1、strA、strB、aphA1、tet（B）、sul2 基因擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致，證明HN1553 菌株攜帶氨基糖苷類耐藥基因aadA1、strA、strB、aphA1，四環(huán)素類耐藥基因tet（B）和磺胺類耐藥基因sul2。

圖6 副豬格拉菌耐藥基因PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.6 PCR results of drug-resistant genes of Glaesserella parasuis

3 討論

副豬格拉菌是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性病原之一，可長(zhǎng)期定植于健康豬的上呼吸道，一旦機(jī)體抗體下降，就可突破機(jī)體防御體系，大量繁殖侵入機(jī)體不同臟器，引起局部病變或全身癥狀，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成不同程度的危害。本研究在河南焦作某豬場(chǎng)的疑似副豬格拉菌病例中，通過細(xì)菌分離、純化、形態(tài)觀察、PCR 鑒定等技術(shù)手段，獲得1 株副豬格拉菌血清2 型菌株HN1553。

細(xì)菌感染機(jī)體發(fā)病是細(xì)菌所有毒力基因共同參與的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)菌粘附、侵入宿主、逃避防御、體內(nèi)繁殖、組織損傷等［18］。副豬格拉菌毒力因子多，致病機(jī)理復(fù)雜，對(duì)HN1553 菌株擴(kuò)增檢測(cè)14 個(gè)常見毒力基因，其中10 個(gè)毒力基因?yàn)殛栃?，說明該菌株攜帶有較多的毒力基因，多個(gè)毒力基因的協(xié)同作用使該菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性。本研究利用豚鼠試驗(yàn)分析了菌株HN1553 的毒力強(qiáng)弱，1×109CFU/mL 濃度菌懸液能使豚鼠100%發(fā)病，80%死亡，與賀云霞等［8］的試驗(yàn)結(jié)果一致。試驗(yàn)過程中，發(fā)病豚鼠均表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，死亡豚鼠有較明顯臟器病變，臟器觸片染色能發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，且能從肝臟、脾臟、腦等器官中分離出感染菌株，表明HN1553 菌株對(duì)豚鼠有較強(qiáng)的致病性，且能夠突破豚鼠的血腦屏障引起腦部感染。

疫苗免疫和抗生素使用是防控副豬格拉菌病的有效途徑，但由于副豬格拉菌血清型之間交叉保護(hù)差，流行菌株和疫苗菌株血清型不一致，導(dǎo)致疫苗臨床防疫效果不佳；同時(shí)養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重，使得藥物抗菌效果越來越差［19］。本研究利用紙片法篩選了菌株HN1553 的敏感藥物，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢氨芐、阿莫西林頭孢類藥物敏感，與先前大部分研究結(jié)果相同；對(duì)左氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星喹諾酮類藥物敏感，與王治方等［20］、萬世平等［21］報(bào)道結(jié)果相同，與王同兆等［22］試驗(yàn)結(jié)果不同。該菌株對(duì)青霉素G、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素耐藥；對(duì)復(fù)方新諾明完全耐藥，與朱孟玲等［23］、史開志等［24］的研究結(jié)果一致。細(xì)菌耐藥表型與其攜帶的耐藥基因有一定關(guān)聯(lián)性，利用PCR 擴(kuò)增技術(shù)對(duì)菌株HN1553 進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶有氨基糖苷類耐藥基因aadA1、strA、strB、aphA1，四環(huán)素類耐藥基因tet（B）和磺胺類耐藥基因sul2，菌株耐藥表型和耐藥基因攜帶基本吻合。規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生副豬格拉菌感染病時(shí)，應(yīng)及時(shí)分離細(xì)菌，篩選敏感藥物，是提高治療效果和降低細(xì)菌耐藥性的關(guān)鍵。此外，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型鑒定，有針對(duì)性地選擇血清型相同的疫苗進(jìn)行免疫接種，是防控該病的首選策略。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)河南某豬場(chǎng)臨床疑似副豬格拉菌病例豬只進(jìn)行病原菌分離鑒定、敏感藥物篩選及臨床藥物治療預(yù)防效果分析，證實(shí)該豬場(chǎng)保育仔豬的臨床癥狀是由副豬格拉菌血清2 型菌株引起的。對(duì)該分離菌株HN1553 的部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該菌株毒力較強(qiáng)，攜帶多個(gè)毒力基因和耐藥基因，對(duì)頭孢類藥物和喹諾酮類藥物敏感，對(duì)氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物耐藥，表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象。本研究為副豬格拉菌血清2 型流行病學(xué)、致病機(jī)制研究提供參考，為副豬格拉菌病的臨床綜合防控提供依據(jù)。