禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因AdPAL1 的克隆與表達分析

張曉東，劉勇江，沙 漠，趙晶晶，李會平，張喜

（許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院，河南 許昌 461000）

【研究意義】禹白芷（Angelica dahuricacv.Yubaizhi）是河南道地藥材，為傘形科當(dāng)歸屬植物白芷的干燥根。禹白芷富含香豆素類、揮發(fā)油類和黃酮類化合物，具有解表散寒，祛風(fēng)止痛，宣通鼻竅，燥濕止帶，消腫排膿等功效，常被用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等病癥［1］。禹白芷位于禹藥之首，被收錄于歷屆《中國藥典》［1］。根據(jù)《地理標(biāo)志產(chǎn)品保護規(guī)定》，我國自2006 年12月28 日起對禹白芷實施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護。由于其獨特的香氣和優(yōu)質(zhì)的特性，禹白芷被廣泛用于中醫(yī)臨床飲片配方、保健品、化妝品和香料等領(lǐng)域［2］。然而，禹白芷生產(chǎn)面臨連作障礙和道地產(chǎn)區(qū)耕地面積逐年減少的問題。因此，利用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)禹白芷的主要藥效成分香豆素具有重要的前景?！厩叭搜芯窟M展】在植物中，香豆素的生物合成起源于苯丙素途徑［3］。苯丙氨酸解氨 酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是苯丙素生物合成途徑的第一個酶（圖1），能夠催化L-苯丙氨酸中氨的氧化，生成反式肉桂酸，并釋放氨氣［4］。在植物中，PAL 由其多基因家族編碼［5］。如擬南芥有4個PAL基因［6］、石防風(fēng)屬植物（Kitagawia praeruptora）有3個PAL基因［7-8］、不同品種咖啡中發(fā)現(xiàn)3～6個PAL基因［9］、生菜有5個PAL基因［10］、馬鈴薯基因組中發(fā)現(xiàn)多達14個PAL基因［11］，在禹白芷轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測有4個PAL基因。目前，PAL基因已從擬南芥［12］、孜然芹［13］、羅勒［5］等許多植物中分離。PAL基因的表達具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導(dǎo)。例如，在前胡中，PpPAL基因主要在根中表達，莖和葉中也有少量表達，且茉莉酸甲酯、紫外線和冷處理均能夠上調(diào)該基因的表達，而過氧化氫、熱處理則下調(diào)該基因的表達［7］；抽薹后，葉中PpPAL1基因表達量急劇上升，而葉中PpPAL2基因表達量急劇下降［8］。在咖啡中，葉銹病真菌可誘導(dǎo)PAL基因表達，與易感品種Caturra 相比，抗性品種Híbrido de Timor的誘導(dǎo)率更高［9］。在孜然芹中，CcPAL在芽中表達量最高，其次是種子，根中的表達量最低，且鎘、受傷、水楊酸和冷處理均可促進其表達［13］。生產(chǎn)上，PAL基因具有廣泛用途。研究發(fā)現(xiàn)，PAL基因是鑒別金針菇顏色的關(guān)鍵基因［14］。改造后的擬南芥PAL 可用于光學(xué)純L-苯丙氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)［12］。噴灑殼聚糖納米顆粒在水稻中可以提升PAL 酶活性、降低水稻種子中苯丙氨酸的含量，為苯丙酮尿癥患者提供低苯丙氨酸的稻米［15］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，禹白芷的研究主要集中在化學(xué)成分鑒定［16］、含量測定［17］以及主要藥效成分的藥理作用［18］等方面。然而，禹白芷AdPAL1基因尚未有相關(guān)報道。為實現(xiàn)在工程菌中高效生產(chǎn)禹白芷中的高價值香豆素成分，必須對香豆素生物合成途徑的基因進行克隆和功能解析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬首先測定禹白芷快速生長期和收獲期根和葉中主要香豆素成分歐前胡素的含量，并同時測定AdPAL1基因同期的表達情況，探究它們之間的相關(guān)性。隨后，根據(jù)禹白芷轉(zhuǎn)錄組中AdPAL1基因序列，設(shè)計特異性引物，利用RT-PCR 技術(shù)從禹白芷根中擴增AdPAL1基因，并進行序列分析和原核表達，以期為禹白芷AdPAL1基因的功能及其在歐前胡素生物合成中的作用機制解析提供參考。

圖1 植物香豆素生物合成途徑Fig.1 Coumarin biosynthesis pathway in plants

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為禹州市中藥材標(biāo)準(zhǔn)化中心提供的禹白芷（Angelica da huricacv.Yubaizhi）種子。2020 年9 月5 日，在許昌學(xué)院道地藥材種植基地播種；并于2021 年6 月29 日（快速生長期）和2021 年7 月29 日（收獲期）采樣?；蚩寺∷貌牧蠟橛戆总频母?，基因組織特異性表達分析所用材料為一年生禹白芷的根（頂端1/5 處）和成熟的大葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 歐前胡素含量測定 采用安捷倫1260 高效液相色譜（HPLC）儀，按照《中國藥典》［1］的方法測定白芷干燥根和干燥葉中歐前胡素的含量。使用梯度濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品均重復(fù)3 次。

1.2.2 根總RNA 提取及AdPAL1基因開放閱讀框（ORF）克隆 按照張玲等［19］的方法提取禹白芷根總RNA、合成cDNA 和克隆AdPAL1基因ORF，獲得重組質(zhì)粒pMD19-AdPAL1。AdPAL1基因引物為AdPAL1NdeI-F：CATATGCTTGTGAGGATCAACACACT（下劃線為NdeI 酶切位點），AdPAL1HindIII-R：AAGCTTAG AAATTGGTAGAGGAGCTCCAT（下劃線為HindIII酶切位點），退火溫度為61 ℃。

1.2.3AdPAL1基因原核表達載體構(gòu)建 通過酶切連接的方法［19］構(gòu)建原核表達載體ProS2-AdPAL1。

1.2.4 AdPAL 蛋白生物信息學(xué)分析 按照張玲等［19］的方法對AdPAL1 蛋白進行生物信息學(xué)分析。利用ProtComp v9.0 軟件預(yù)測蛋白的亞細胞定位情況。使用STRING 網(wǎng)站對AdPAL1 蛋白與其他蛋白間的互作進行預(yù)測［20］。多序列比對和進化樹構(gòu)建所使用蛋白的GenBank 登錄號分別為：綠竹Bambusa oldhamii，BoPAL（AAR24505.1）；水稻Oryza sativaindica group，OsPAL（CAA61198.1）；青稞Hordeum vulgaresubsp.vulgare，HvPAL（CAA89007.1）；小麥Triticum aestivum，TaPAL（CAA68036.1）；小立碗蘚Physcomitrella patens，PpaPAL（XP_001760495.1）；銀杏Ginkgo biloba，GbiPAL（ABU49842.1）；麻黃Ephedra sinica，EsPAL（BAG74770.1）；歐洲云杉Picea abies，PaPAL（CAK 22402.1）；火炬松Pinus taeda，PtaPAL（AAA84889.1）；罌粟Papaver somniferum，PsPAL（XP_026403210.1）；毛果楊Populus trichocarpa，PtPAL（ACC63889.1）；狹葉油茶Camellia lanceoleosa，ClPAL（KAI8012953.1）；小葉種茶Camellia sinensisvar.sinensis，CsPALd（QIH97409.1）；石防風(fēng)屬植物Kitagawia praeruptora，KpPAL1（UXG20228.1）、KpPAL2（UXG20229.1）；美味獼猴桃Actinidia deliciosa，AdePAL2（QED11031.1）；中華獼猴桃Actinidia chinensisvar.chinensis，AcPAL（PSS23706.1）；紫花前胡Angelica decursiva，AdecPAL（QCY50324.1）；野胡蘿卜Daucus carota，DcPAL（BAC56977.1）；歐芹Petroselinum crispum，PcPAL3（P45729.1）；當(dāng)歸Angelica sinensis，AsPAL（AJW77399.1）；金銀花Lonicera japonica，LjPAL（AGE10589.1）；灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides，LmPAL（AZR37753.1）；藍靛忍冬Lonicera caerulea，LcPA（ALU09327.1）；萵苣Lactuca sativa，LsPAL（XP_023767814.1）；雪蓮Saussurea involucrata，SiPAL（ALK02780.1）；刺苞菜薊Cynara cardunculusvar.scolymus，CcPAL（XP_024986252.1）；青蒿Artemisia annua，AaPAL（AKP55356.1）；紅鳳菜Gynura bicolor，GbPAL（BAJ17655.1）；西洋梨Pyrus communis，PcPAL（AGL81344.1）；芝麻Sesamum indicum，SinPAL（XP_011077338.1）；向日葵Helianthus annuus，HaPAL（KAJ0657456.1）；非洲菊Gerbera jamesonii，GjPAL（QBC35985.1）；蘋果Malus domestica，MdPAL1（XP_008387584.2）；紫蘇Perilla frutescens，PfPAL（AEZ67457.1）；禹白芷Angelica dahuricacv.Yubaizhi，AdAPL1（WGD08245.1），AdPAL2（WGD08246.1）。

1.2.5AdPAL1基因的原核表達 參照張玲等［19］的方法進行重組質(zhì)粒ProS2-AdPAL1的原核表達與SDS-PAGE 檢測。菌體收集后，使用1×PBS洗滌菌體，使用JY92-IIDN 型超聲細胞破碎儀（新芝，寧波）進行細胞破碎。4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，分離上清和沉淀。

1.2.6AdPAL1基因的組織特異性表達分析 分別取一年生快速生長期和收獲期禹白芷的根和葉，按照張玲等［19］的方法進行AdPAL1基因的組織特異性表達分析。選擇AdSAND基因［21］作為內(nèi)參，引物為qAdSAND-F：5'-TGCTGGAGGAAAGGGGAC-3' 和qAdSAND-R：5'-GCCATTTCCCAGGGACCC-3'，PCR條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s。AdPAL1引物為qAdPAL1-F：5'-AGTGCTAGGGCTGTGCTTG-3' 和qAdPAL1-R：5'-TCCTCTCCAGGCGATGTCA-3'，PCR 條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s。每個反應(yīng)重復(fù)3 次。反應(yīng)在Archimed X4 熒光定量PCR 儀（鯤鵬基因，北京）上進行擴增，擴增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR 儀軟件自動生成。使用內(nèi)參基因校準(zhǔn)后，分別計算根和葉中AdPAL1基因相對表達量。采用2-△△Ct的方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用Origin 2018C 對歐前胡素含量和AdPAL1基因的表達量進行顯著性分析。使用Excel 2019 中的CORREL 函數(shù)計算快速生長期與收獲期歐前胡素變化量、AdPAL1基因表達變化量的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐前胡素含量測定

分別對禹白芷快速生長期和收獲期根和葉中的歐前胡素含量進行測定，結(jié)果（圖2）表明，兩個時期根中的歐前胡素含量均顯著高于葉，并且在快速生長期根和葉中的歐前胡素含量均略高于收獲期。

圖2 不同生長時期根和葉中的歐前胡素含量Fig.2 Content of imperatorin in roots and leaves at different growth stages

2.2 AdPAL1 基因的組織特異性表達分析

取禹白芷快速生長期和收獲期的根和葉，通過qRT-PCR 分析AdPAL1基因在不同組織中的表達情況。結(jié)果（圖3）表明，快速生長期根中AdPAL1基因的表達量顯著高于葉，約是葉中表達量的21 倍；收獲期根中AdPAL1基因的表達量約為葉中的50.21%。此外，根中AdPAL1基因表達變化量與歐前胡素累積變化量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.46（中度相關(guān)），而葉中AdPAL1基因表達變化量與歐前胡素累積變化量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.17（弱相關(guān)），綜合以上研究結(jié)果，初步判斷在根中AdPAL1基因參與歐前胡素的生物合成。

圖3 不同生長時期根和葉中的AdPAL1 基因相對表達Fig.3 Relative expression of AdPAL1 gene in roots and leaves at different growth stages

2.3 禹白芷AdPAL1 基因序列克隆

以禹白芷幼葉cDNA 為模板，使用特異性引物擴增出約2 000 bp 的片段（圖4）。通過TA 克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-AdPAL1，酶切檢測結(jié)果顯示雙酶切獲得的2 個DNA 片段大小之和等于單酶切片段大小，表明AdPAL1基因已成功插入到pMD19T 載體中。

圖4 AdPAL1 基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification result of AdPAL1 gene

2.4 AdPAL1 蛋白生物信息學(xué)分析

利用Genetyx 和DNAMAN 軟件對AdPAL1基因ORF 序列進行分析，結(jié)果表明AdPAL1基因ORF 長1 764 bp，編碼557 個氨基酸。本研究中所克隆到的AdPAL1基因與二代轉(zhuǎn)錄組拼接獲得的AdPAL1核苷酸序列并不完全一致，二者相似性為99.64%。將該序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank 登錄號為OQ822236。

使用GenBank 數(shù)據(jù)庫中的BLASTp 程序?qū)dP AL 1蛋白進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)禹白芷AdPAL1 與石防風(fēng)屬植物KpPAL2 蛋白序列相似性最高（99.28%），與紫蘇（Perilla frutescens）PfPAL 蛋白相似性稍低（88.31%）。利用DNAMAN 將AdPAL1 蛋白序列與從NCBI 中挑選的相似性較高的部分序列進行多序列比對分析，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白與已知蛋白相似性很高，在第39～54 位氨基酸殘基之間含有保守基序“GTITASGDLVPLSYIA” 和Ala-Ser-Gly 催 化三聯(lián)體，這被預(yù)測為典型的苯丙氨酸和組氨酸解氨酶（HAL）特征模式［22-23］（圖5）。此外，AdPAL1 蛋白還包含PAL 保守催化活性位點，如GLALVNG（96～102）、NDN（223～225）和HNQDV（327～331）［8,24］（圖5）。利用IQTREE2將AdPAL1 蛋白序列與已發(fā)表文獻中相似性較高的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果進化樹分為4 個進化枝，分別為單子葉植物、苔蘚植物、裸子植物和雙子葉植物，其中禹白芷AdPAL1 蛋白與傘形科植物當(dāng)歸、歐芹、野胡蘿卜、紫花前胡、石防風(fēng)屬植物的PAL 蛋白聚為同一大進化枝，尤其是與石防風(fēng)屬植物KpPAL2 蛋白處于同一小進化枝（圖6），表明二者親緣關(guān)系較近，具有相似或相同的結(jié)構(gòu)與功能。

圖5 AdPAL1 蛋白與其他植物PAL 蛋白的多序列比對結(jié)果Fig.5 Multiple sequence alignment results of AdPAL1 protein with other plant PAL proteins

圖6 AdPAL1 蛋白與其他植物中PAL 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of AdPAL1 protein and other plant PAL proteins

使用ExPASy ProtParam tool 對AdPAL1 蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白單體相對分子質(zhì)量為61.10 kD，理論等電點（pI）為5.92；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為62，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）為54。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為36.77，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為93.68，總平均疏水性（GRAVY）為-0.124，為親水蛋白。AdPAL1 蛋白含有20 種基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高、為11.10%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分別為7.90%和7.50%；色氨酸含量最低、為0.4%。

利用SSpro 方法對AdPAL1 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占58.53%，無規(guī)則卷曲（C）占38.78%，延伸帶（E）占2.69%。利用Swiss-Model Workspace 使用自動模式預(yù)測AdPAL1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該模型為同源四聚體（圖7），是以歐芹苯丙氨酸解氨酶［6f6t.1.A］為模板，在第1～557 位氨基酸處建模，序列相似度為94.23%。使用SMART 軟件進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白在第1～338 氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶結(jié)構(gòu)域。使用InterPro 在線工具對AdPAL1 蛋白進行蛋白家族歸類分析，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白屬于芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1～556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1～547）亞家族成員。

圖7 AdPAL1 蛋白四聚體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 3D Structure prediction of AdPAL1 protein tetramer

使用SignalP 6.0 服務(wù)器分析AdPAL1 蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM 工具預(yù)測AdPAL1 蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域，為非膜蛋白。利用亞細胞定位軟件ProtComp 9.0 預(yù)測AdPAL1 蛋白，結(jié)果顯示其定位于細胞質(zhì)。

蛋白相互作用預(yù)測結(jié)果表明，AdPAL1 蛋白與C4H、4CL1、4CL2、4CL3、4CL5、HISB6B、AAS、ACOS5（類4CL 酶）、CCoAMT1、AT4G05160等10 個蛋白存在互作，其中PAL、C4H、4CL、CCoAMT 是簡單香豆素生物合成的催化酶，AAS參與細胞氨基酸代謝，AT4G05160 參與脂肪酸的激活，HISN6B 為參與組氨酸生物合成的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)氨酶（圖8）。

圖8 AdPAL1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果Fig.8 AdPAL1 protein interaction network prediction results

2.5 AdPAL1 基因原核表達載體構(gòu)建

使用NdeI和HindIII 雙酶切質(zhì)粒ProS2-AdPAL1，可切出目的片段和載體，且兩片段之和等于單酶切片段長度（圖9），表明AdPAL1基因已成功插入原核表達載體ProS2 中。

圖9 質(zhì)粒ProS2-AdPAL1 酶切檢測結(jié)果Fig.9 Enzyme digestion detection results of plasmid ProS2-AdPAL1

2.6 AdPAL1 基因原核表達

將重組質(zhì)粒ProS2-AdPAL1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，使用IPTG進行誘導(dǎo)表達。在15 ℃、終濃度為0.5 mmol/L IPTG 下，分別誘導(dǎo)表達0、2、4、6、8 h后，提取細菌總蛋白進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與對照相比，ProS2-AdPAL1轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，在相對分子質(zhì)量84 kD（含Protein S 標(biāo)簽蛋白23 kD）左右有1 條蛋白條帶，并且隨誘導(dǎo)時間增加其蛋白含量逐漸增加，表明重組質(zhì)粒ProS2-AdPAL1在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)表達了AdPAL1 蛋白。當(dāng)溫度為15 ℃、誘導(dǎo)時間為6 h 時，蛋白表達量最高（圖10）。為檢測AdPAL1 融合蛋白的存在形式，對誘導(dǎo)表達8 h 的菌體進行超聲破碎，然后使用SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明AdPAL1 蛋白全部以包涵體形式存在（圖11）。

圖10 15 ℃下不同誘導(dǎo)時間對AdPAL1 蛋白表達的影響Fig.10 Effects of different induction times on AdPAL1 protein expression at 15 ℃

圖11 AdPAL1 重組蛋白存在形式的檢測Fig.11 Detection of the presence form of AdPAL1 recombinant protein

3 討論

植物PAL 在介導(dǎo)和協(xié)調(diào)初級到次級代謝的碳通量方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這對于植物應(yīng)對不同的環(huán)境條件以適應(yīng)和優(yōu)化生長至關(guān)重要［25］。禹白芷的主要藥效成分為香豆素類化合物，通過苯丙素途徑合成［3］。在植物中，PAL 是苯丙素途徑的第一個限速酶［26］。因此，禹白芷AdPAL基因的表達情況直接或間接影響香豆素的生物合成。本研究中，不同生長時期禹白芷根和葉中歐前胡素變化量與AdPAL1基因表達變化量具有中度相關(guān)性，判斷AdPAL1基因可能參與歐前胡素的生物合成。因此，對禹白芷AdPAL1基因進行克隆和生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明所克隆的AdPAL1基因ORF 全長1 764 bp，編碼557 個氨基酸，pI為5.92，其與番紅花CsPAL 蛋白（559 aa，pI 為5.7）類似，但比白花前胡PpPAL1（718 aa，pI 為6.25）和PpPAL2 蛋白（705 aa，pI 為6.16）5′端要短［8］，比孜然CcPAL 蛋白（116 aa，pI 為5.85）要長得多［13］。蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，AdPAL1蛋白在第1～338 位氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶結(jié)構(gòu)域。InterPro 軟件則將AdPAL1 蛋白歸類為芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1～556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1～547）亞家族成員。事實上，芳香族氨基酸裂解酶家族包含苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC4.3.1.24）、組氨酸解氨酶（HAL，EC24.3.1.3）和酪氨酸氨基變位酶（EC5.4.3.6）三類［27-29］。PAL 和HAL 是類裂合酶I 超家族成員，均催化類似的β 消除反應(yīng)，形成同源四聚體才具有活性，且二者均具有翻譯后環(huán)化特征及催化作用的Ala-Ser-Gly 三位一體結(jié)構(gòu)［30］。PAL 是植物和真菌中苯丙素組裝的關(guān)鍵生物合成催化劑，并參與多種次生代謝產(chǎn)物如黃烷類、呋喃香豆素類植保素及細胞壁成分的生物合成。這些化合物對于植物正常生長和環(huán)境脅迫響應(yīng)至關(guān)重要。HAL 催化組氨酸降解的第一步，即從組氨酸中去除氨基團以產(chǎn)生尿刊酸。PAL 和HAL 中的核心結(jié)構(gòu)域約有30%的序列一致性，其中PAL包含從共同折疊處延伸的約160個殘基［31］。酪氨酸2,3-氨基突變酶具有氨基突變酶活性，并且在較小程度上具有氨裂解酶活性［32］。這表明AdPAL1 為苯丙氨酸解氨酶。近期研究發(fā)現(xiàn)，石防風(fēng)屬植物KpPAL2 能夠催化從L-苯丙氨酸到反式肉桂酸的反應(yīng)［8］。本研究中，AdPAL1 蛋白與KpPAL2 蛋白序列相似性高達78.44%，并與KpPAL2 處于同一進化枝，這進一步表明AdPAL1為苯丙氨酸解氨酶。因此，本研究所克隆基因為PAL基因。

在植物中，蛋白的亞細胞定位對于基因功能的解析至關(guān)重要。在本研究中，預(yù)測結(jié)果顯示AdPAL1 蛋白定位于細胞質(zhì)，這與白花前胡中PpPAL 蛋白定位于細胞質(zhì)的結(jié)果相一致［7］。PAL基因的表達也具有組織和時空特異性，并與活性化合物的生物合成相關(guān)聯(lián)。在前胡中，MeJA、UV 和冷處理誘導(dǎo)的PpPAL基因表達與白花前胡甲素含量呈正相關(guān)［7］。在巴戟天中，McPAL3在葉片和成熟果實中表達，McPAL2僅在葉片中表達，McPAL1主要在果實幼齡期表達，但僅有McPAL3的表達模式與東莨菪內(nèi)酯含量累積規(guī)律一致［33］。半夏的藥用部位為塊莖，PtPAL基因在葉中表達量最高，其次是塊莖和根，花中表達量最低［34］。冬凌草的藥用部位為莖和葉，IrPAL基因在葉片中表達量最高，莖次之，根中表達量最低［35］。本研究中，禹白芷的藥用部位為根，且快速生長期的AdPAL1基因主要在根中表達，收獲期在根中的表達量下降約50%，這暗示AdPAL1基因參與禹白芷歐前胡素的生物合成。此外，收獲期禹白芷葉片中AdPAL1基因的表達量顯著高于快速生長期，這與巴戟天中老葉McPAL3基因的表達量遠遠高于幼葉和成熟葉的現(xiàn)象一致［33］。這可能是老葉中乙烯含量升高［36］，并誘導(dǎo)AdPAL1和McPAL3基因上調(diào)表達的結(jié)果［33］。下一步將對AdPAL1 蛋白進行純化和酶活分析，為進一步闡明禹白芷歐前胡素生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，根中AdPAL1基因表達的變化與歐前胡素含量的變化呈中度相關(guān)，初步證明AdPAL1基因參與了歐前胡素的生物合成。成功克隆AdPAL1基因，該基因ORF 長1 764 bp，編碼557 個氨基酸，單體相對分子質(zhì)量為61.10 kD，理論等電點為5.92。AdPAL1 蛋白為親水穩(wěn)定蛋白，定位于細胞質(zhì)，無信號肽、跨膜螺旋區(qū)域，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，三級結(jié)構(gòu)呈同源四聚體形式。AdPAL1 與石防風(fēng)屬植物KpPAL2 蛋白親緣關(guān)系最近，且可能與香豆素生物合成途徑中的C4H、4CL、CCoAMT等蛋白存在相互作用。構(gòu)建原核表達載體ProS2-AdPAL1，并在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達出AdPAL1 蛋白，表達形式為包涵體。本研究結(jié)果對于揭示AdPAL1基因的功能和歐前胡素生物合成途徑具有重要參考價值。