潘夏艷 朱鳳 周晨 于俊杰 俞咪娜 宋天巧 曹慧娟 劉永鋒
摘要:前期研究發(fā)現(xiàn)江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn),為進(jìn)一步明確江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)展規(guī)律,指導(dǎo)全省三唑類殺菌劑的科學(xué)使用,利用菌絲生長速率法,測定了2020年江蘇省6個(gè)地區(qū)和2021年江蘇省7個(gè)地區(qū)共計(jì)219個(gè)稻曲病菌單孢菌株對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性,并通過測定抗性菌株的生長速率和對(duì)水稻的致病力對(duì)其適合度進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,2020年采集的84株稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑均敏感;2021年,在靖江市監(jiān)測到1株抗藥性菌株,該市抗性頻率為6.7%,全省抗性頻率為0.7%;抗性水平2.2倍。進(jìn)一步對(duì)篩選到的稻曲病菌抗藥性菌株適合分析發(fā)現(xiàn),抗藥性菌株生長和致病力與敏感菌株相比均無顯著差異,表明在三唑類殺菌劑的田間選擇壓下,抗藥性可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。本研究明確了江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在低抗藥性風(fēng)險(xiǎn),目前在做好抗藥性監(jiān)測的前提下,三唑類殺菌劑可繼續(xù)作為江蘇省防治稻曲病的主要藥劑。
關(guān)鍵詞:稻曲病菌;三唑類殺菌劑;抗藥性;適合度
中圖分類號(hào):S482.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2023)05-0134-05
稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens,有性態(tài)Villosiclava virens)侵染水稻穗部引起的一種世界性真菌病害[1-2]。稻曲病不僅造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn),而且稻曲病菌分泌的毒素會(huì)對(duì)人畜造成一定的毒害作用[3-5]。近年來由于雜交水稻品種的推廣種植、化學(xué)肥料的過度使用等因素,我國水稻種植區(qū)稻曲病危害不斷加重,嚴(yán)重威脅我國糧食安全[6-9]。利用三唑類殺菌劑對(duì)稻曲病進(jìn)行綜合防控是當(dāng)下控制該病害流行的重要措施[10-12]。然而,隨著三唑類殺菌劑長期、廣泛被使用,筆者所在課題組自2015年起已在江蘇省多地監(jiān)測到稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的田間抗藥性菌株,且具有較高的適合度,表明江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[13-15]。為進(jìn)一步明確江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生分布范圍和抗藥性發(fā)展規(guī)律,本研究連續(xù)2年監(jiān)測了江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性,評(píng)估了三唑類殺菌劑防治稻曲病的抗性風(fēng)險(xiǎn),以期為生產(chǎn)上三唑類殺菌劑的科學(xué)使用及抗藥性治理策略的制定提供理論指導(dǎo)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試藥劑和菌株
丙環(huán)唑原藥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供,用甲醇配成10 g/L的母液,于4 ℃冰箱貯存,備用。
2020年供試菌株為84株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、揚(yáng)州市儀征市、南京市、南通市、泰州市靖江市和鹽城市東臺(tái)市6個(gè)地區(qū),采樣水稻品種為南粳5055、南粳9108、金粳818、徽兩優(yōu)絲苗、春優(yōu)301、隆兩優(yōu)1686、深兩優(yōu)5814和淮稻5號(hào)等12個(gè)水稻品種。具體采樣情況如表1所示。2021年供試菌株共計(jì)135株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、南京市、淮安市、連云港市、鹽城市東臺(tái)市、南通市和泰州市靖江市7個(gè)地區(qū),采樣水稻品種為南粳系、荃優(yōu)系、徐稻系、金陵香粳、金香玉1號(hào)、鹽粳7號(hào)、淮稻5號(hào)等20多個(gè)水稻品種。具體采樣情況如表2所示。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 稻曲病菌單孢菌株的分離 用滅菌手術(shù)刀將稻曲球?qū)Π肭虚_,無菌牙簽挑取稻曲球中部白色菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA: 1 L中含200 g馬鈴薯煮沸過濾液、20 g蔗糖和15 g瓊脂粉)平板上,于28 ℃培養(yǎng)3~5 d。挑取菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的PSB培養(yǎng)液中,28 ℃、150 r/min搖培5 d后,吸取孢子液顯微觀察產(chǎn)孢情況并將孢子液調(diào)至濃度為1.0×104 個(gè)/mL,取 1 μL 上述孢子液于100 μL無菌水中混勻后涂布于PSA平板上,28 ℃培養(yǎng)5 d,單個(gè)孢子萌發(fā)形成的菌落即為稻曲病菌單孢菌株,保存于試管中備用。
1.2.2 稻曲病菌抗藥性菌株的篩選 綜合分析筆者所在研究室2018年建立的江蘇省稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性基線[4]和測定的田間稻曲病菌敏感菌株對(duì)丙環(huán)唑最小抑制濃度(MIC)0.5 mg/L,本研究將1.0 mg/L作為稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑田間抗藥性監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn),即能在1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑的抗藥性菌株,不能在含 1.0 mg/L 丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑敏感菌株。將供試菌株在28 ℃培養(yǎng)箱倒置預(yù)培養(yǎng)15 d,制成5 mm的菌碟后接種于含1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板中央,28 ℃倒置培養(yǎng)20 d,觀察菌株生長情況。每個(gè)處理重復(fù)3次。
1.2.3 稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性[16],具體步驟如下:將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d,取直徑5 mm菌齡一致的菌碟轉(zhuǎn)移至含系列濃度梯度的丙環(huán)唑PSA平板(直徑為6 cm)中央,甲醇為陰性對(duì)照,丙環(huán)唑濃度梯度設(shè)置為0.019 5、0.078 1、0.312 5、1.25、5 mg/L。每個(gè)濃度梯度3個(gè)重復(fù),倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),20 d后測量供試菌株在不同濃度含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑,并用DPS軟件計(jì)算丙環(huán)唑?qū)Ω鞴┰嚲甑囊种浦袧舛菶C50值。本試驗(yàn)重復(fù)3次
1.2.4 抗性水平劃分 按照以下公式計(jì)算三唑類殺菌劑的抗性頻率和抗性水平。
抗性頻率=(抗藥性菌株數(shù)/總菌株數(shù))×100%;
抗性水平=供試稻曲病菌EC50/平均EC50值(平均EC50值為2018年本研究室建立的敏感性基線0.05 mg/L)。
當(dāng)抗性水平≤1時(shí),該菌株為敏感菌株,當(dāng)抗性水平>1且≤5時(shí),該菌株為低抗菌株,當(dāng)抗性水平>5且≤10為中抗菌株,當(dāng)抗性水平>10時(shí),該菌株為高抗菌株。
1.2.5 抗藥性菌株適合度分析 (1)生長速率測定:將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d,取直徑5 mm的菌碟于PSA平板中央,倒置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d后測量菌落直徑并拍照,SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),本試驗(yàn)重復(fù)2次。(2)致病力測定:參照俞咪娜等的方法[17]稍作修改,取新鮮的供試菌株的菌碟于PSB培養(yǎng)液中于28 ℃、150 r/min搖培5 d后,顯微觀察孢子濃度并調(diào)至1.0×106個(gè)/mL,然后將菌絲塊和孢子液一起打碎作為接種體,注射器接種1 mL接種體至破口前5~7 d的兩優(yōu)培九穗苞中,每個(gè)菌株接種10穗,接種30 d后調(diào)查每穗稻曲球數(shù)并拍照,SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本試驗(yàn)重復(fù)2次。
2 結(jié)果與分析
2.1 江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測
本研究共分離獲得2020年來自江蘇省6個(gè)地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株84株,2021年來自江蘇省7個(gè)地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株135株,總計(jì)219株。對(duì)其抗藥性監(jiān)測結(jié)果表明:2020年所有菌株均為敏感菌株,2021年靖江市有1株菌株能在1.0 mg/L含丙環(huán)唑的平板上生長,為稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株,江蘇省稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的抗性頻率為0.7%,靖江市抗性頻率為6.7%(表3)。
2.2 稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑敏感性測定和抗性水平分析
對(duì)篩選獲得的稻曲病菌抗藥性菌株2021-128進(jìn)行了丙環(huán)唑敏感性測定(圖1),得出2021-128對(duì)丙環(huán)唑的EC50值為0.11 mg/L,抗性水平為2.2倍,為低抗菌株。
2.3 稻曲病菌抗性菌株適合度分析
對(duì)稻曲病菌抗藥性菌株生長速率和致病力測定發(fā)現(xiàn),抗藥性菌株2021-128與敏感菌株2021-30相比,生長速率(圖2-A、圖2-B)和致病力(圖2-C、圖2-D)均無顯著差異,表明該抗藥性菌株田間適合度沒有降低。
3 討論
稻曲病主要依賴于化學(xué)藥劑防控,防治關(guān)鍵時(shí)期為水稻穗期,即破口前5~7 d施用丙環(huán)唑、戊唑醇等三唑類殺菌劑和井岡霉素為主[18-21]。在其他糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物病害病原菌中,三唑類殺菌劑的抗性屢見報(bào)道,如小麥褐銹菌(Puccinia triticina)、柑橘綠霉病菌(Penicillium digitatum)、瓜類白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、大麥白粉病菌
graminis f. sp. hordei)等都對(duì)三唑類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[22-24]。王菲等人曾通過室內(nèi)紫外誘變的方法,成功獲得稻曲病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性菌株[25]。筆者所在研究室通過對(duì)稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑多年的田間抗藥性監(jiān)測,于2015年在江蘇省淮安市首次監(jiān)測到2株稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株[13],2017年在江蘇省徐州市、淮安市和常州市金壇區(qū)以及2019年在江蘇淮安市、徐州市、常州市金壇區(qū)和連云港市多地均監(jiān)測到稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑田間抗藥性菌株,且部分抗藥性菌株田間適合度高,表明稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑可能存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。因此,探明江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性病原群體發(fā)生發(fā)展規(guī)律,對(duì)指導(dǎo)科學(xué)使用三唑類殺菌劑、高效防控稻曲病具有重要意義。
本研究繼續(xù)監(jiān)測了2020—2021年江蘇省田間稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性,結(jié)果表明2020年江蘇省各地區(qū)未監(jiān)測到田間抗藥性菌株;2021年于江蘇省靖江市監(jiān)測到1株田間抗藥性菌株,抗性頻率低,且為低抗藥性菌株。這表明稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的田間抗藥性發(fā)展較慢,目前還沒有呈動(dòng)態(tài)上升發(fā)展趨勢。但是2021年監(jiān)測到的抗藥性菌株適合度較高,在田間三唑類殺菌劑選擇壓力下,田間抗性可能會(huì)發(fā)展較快。此外,值得注意的是,較往年,靖江市為新增監(jiān)測到田間抗藥性菌株的地區(qū)。從2015年至今,稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生范圍已從淮安市擴(kuò)展到徐州市、常州市金壇區(qū)、連云港市以及泰州市靖江市,主要集中在蘇北地區(qū)。綜上,盡管稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑抗藥性發(fā)展緩慢,但介于抗藥性菌株的田間適合度和擴(kuò)展范圍,仍需加強(qiáng)我省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測,了解抗藥性病原群體變化動(dòng)態(tài),及時(shí)采取不同的抗藥性治理策略,延緩抗藥性的發(fā)生發(fā)展,從而延長三唑類殺菌劑在我省稻曲病防控中的使用壽命。
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收稿日期:2022-11-30
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):32001943)。
作者簡介:潘夏艷(1990—),女,江蘇常熟人,博士,助理研究員,研究方向?yàn)橹参锊『Ψ揽亍-mail:panxy@jaas.ac.cn。
通信作者:劉永鋒,博士,研究員,研究方向?yàn)樗静『Σ≡虏C(jī)制及綠色防控技術(shù)。E-mail:liuyf@jaas.ac.cn。