海水浸泡對火器傷致兔股骨開放性骨缺損愈合影響的實驗研究

張 淦,劉勝杰,王 智,陳聰聰,馬武秀,陳肖松

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院 骨科, 安徽 合肥 230031)

骨缺損是臨床上常見的損傷,由爆炸物、車禍或者外傷引起損傷。由于創(chuàng)傷嚴重,因此感染的風險高,不及時或不恰當?shù)闹委熞滓鸸遣贿B、延遲愈合等。海水具有高滲、高堿、低溫、含菌量高等特點。海水浸泡可通過損傷骨折斷端骨痂成骨細胞中細胞膜、線粒體等,進而影響骨折愈合[1]。王長生等[2]通過海水浸泡骨折斷端處骨膜,表明海水浸泡影響骨膜,膜內成骨明顯延緩。海水浸泡火器傷較單純火器傷組織損傷更加嚴重,浸泡時間越長,損傷程度越重。海水浸泡會加重局部血流循環(huán),最終加重損傷周圍組織缺血缺氧[3]。但海水浸泡對火器傷所致的骨缺損愈合的影響,國內外未見報道。因此本文探討海水浸泡對火器傷所致肢體開放性骨缺損愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 OLYMPUS-IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司);鋼板及螺釘(常州康輝醫(yī)療器械有限公司);20%烏拉坦(上海士鋒生物科技有限公司);熒光定量PCR儀(Bio-rad);中國東風速射運動手槍SS04型,口徑為5.6 mm;子彈質量2.5 g;人工海水由天津中鹽公司提供,海水主要理化指標:滲透壓(1 250.00±11.52) mmol/L,pH值8.20,鈉離子濃度(630.00±53.30)mmol/L,平均密度1.025 g/cm3。

1.2 實驗動物 56只新西蘭大耳兔,由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供,體重2.5～3.0 kg,雌雄不拘,清潔級。

1.3 實驗分組 隨機分為2組,每組28只。對照組:單純火器傷組;實驗組:海水浸泡火器傷組。

1.4 手術方法 以20%烏拉坦(4 mg/)耳緣靜脈麻醉。隨機選擇一側兔后肢,大腿去毛。于兔后肢股骨中段進行槍擊,槍口距離20 cm,造成股骨干開放性骨缺損。A組(對照組)行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復位內固定,一期閉合傷口。B組(海水浸泡火器傷組)將兔浸泡于人工海水1 h,之后再行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復位內固定,一期閉合傷口。術后實驗動物分籠飼養(yǎng),隔日換藥,1周后予以傷口拆線。實驗兔每天給予肌肉注射青霉素40萬單位,連續(xù)注射3 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 放射學檢查 于術后第1、3天、第1、2、4、8、12周各取6只行X線攝片,觀察骨痂生長情況。

1.5.2 RT-PCR檢測 攝片處死后取材進行實驗室檢測,收集各組兔股骨骨痂組織,按照TRlzol試劑說明書提取樣本的總RNA,用紫外分光度計測量總RNA的濃度,按照反轉錄試劑盒說明書的方法將RNA反轉錄為cDNA,然后進行RT-PCR檢測,觀察骨缺損部位周圍骨痂組織中缺氧誘導因子-1α mRNA(HIF-1α mRNA)、血管內皮生長因子mRNA(VEGF mRNA)表達情況。引物序列:HIF-1α(F)5’-TCTCATCCAAGAAGCCCTAACG-3’,(R)5’-GGCTGCTGTAATAATGTCCCAAT-3’;VEGF(F)5’-TCCACCCACGACAGAAGGGGA-3’,(R)5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3。GAPDH(F)5’-TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3’,(R)5’-CGTTCTCAGCCTTGACCGTG-3’。反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃、10 s,55 ℃、20 s,40個循環(huán)。溶解曲線:95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,95 ℃、10 s,以GAPDH作為內參,用2-ΔΔt方法計算出HIF-1α、VEGF的相對表達量。

1.5.3 骨組織HE染色 于術后第2、4、8、12周攝片后,各組隨機處死6只,取股骨原來缺損區(qū)域骨組織,將標本用福爾馬林固定1 d,EDTA脫鈣1個月,石蠟包埋,行HE染色,觀察病理改變。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況 實驗兔有1只在麻醉后死亡,立即補齊。術后1 d,實驗兔開始活動和進食,B組有1只兔傷口出現(xiàn)感染,青霉素80萬單位肌注,3 d后死亡,補做1只實驗兔。其余實驗兔傷口未出現(xiàn)感染,一期愈合。

2.2 HIF-1α mRNA及VEGF mRNA表達 各組各個時間段HIF-1α mRNA均有表達,兩組HIF-1α mRNA表達隨著時間增加先呈遞增趨勢,之后出現(xiàn)遞減,高峰出現(xiàn)在術后第2 周。術后1、3 d,1、2周,A組(對照組)HIF-1α mRNA表達低于B組(實驗組),差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05);術后4、8、12周,兩組HIF-1α mRNA表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1)。各組各個時間段VEGF mRNA均有表達,兩組VEGF mRNA表達隨著時間增加先呈遞增趨勢,之后出現(xiàn)遞減,高峰出現(xiàn)在術后第2 周,術后1、3 d及1、2、4周,A組(對照組)VEGF mRNA表達高于B組(實驗組),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);術后8、12周,兩組VEGF mRNA表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

表1 不同時間點HIF-1α mRNA的相對表達量

表2 不同時間點VEGF mRNA的相對表達量

2.3 影像學觀察 術后第2周A、B組未見明顯骨組織影,術后第4周A、B組骨缺損區(qū)有薄云狀骨痂陰影。術后第8周A、B組骨缺損區(qū)域骨組織陰影增強。術后第12周,A組斷端達骨性愈合,髓腔部分再通,部分完成修復;B組皮質連續(xù)性好,但髓腔未完全再通(圖1)。

A:對照組術后第2周X線片;B:對照組術后第4周X線片;C:對照組術后第8周X線片;D:對照組術后第12周X線片;E:實驗組術后第2周X線片;F:實驗組術后第4周X線片;G:實驗組術后第8周X線片;H:實驗組術后第12周X線片。圖1 不同時間點兩組兔股骨攝片

2.4 組織學觀察 術后第2周A組骨缺損區(qū)域骨細胞變性,少量纖維組織、肉芽組織增生,少量炎細胞浸潤,血管增生不明顯。B組骨缺損區(qū)骨細胞變性,纖維組織增生,較多炎細胞浸潤。術后第4周,A組纖維組織增生活躍,軟骨組織增生,骨樣基質形成,血管增生明顯。B組以纖維組織增生為主,少量軟骨組織增生,偶見骨樣組織形成,少許血管增生。術后第8周,A組可見纖維組織減少,大量編織骨形成,可見不規(guī)則骨小梁。B組可見少量軟骨組織形成,骨樣基質形成,未見不規(guī)則骨小梁。術后第12周,A組大量成熟板層骨,骨小梁較規(guī)則排列,髓腔部分再通;B組少量成熟板層骨,骨小梁不規(guī)則骨小梁,骨小梁窄細、稀少,髓腔未通(圖2)。各組術后第2、4、8、12周Lane-Sandhu組織學評分比較(表3)。

A:對照組術后第2周;B:對照組術后第4周;C:對照組術后第8周;D:對照組術后第12周;E:實驗組術后第2周;F:實驗組術后第4周;G:實驗組術后第8周;H:實驗組術后第12周。圖2 不同時間點兩組兔骨組織HE染色

表3 不同時間點Lane-Sandhu組織學評分

3 討論

海水具有高滲、高堿、低溫和含菌量高等特點。堿性海水可以引起細胞內外離子濃度失衡,加重細胞損傷反應,最終導致細胞壞死。堿性海水抑制凝血機制,加重了損傷組織小血管出血,浸泡后組織細胞內脫水,間隙水腫,外周灌注減少,浸泡出水后,外周灌注改善,發(fā)生缺血再灌注損傷。高滲海水進入損傷組織,使得細胞內外離子濃度差加大,從而增加細胞膜上離子泵的負擔,消耗更多的能量,誘發(fā)氧化還原反應,抑制細胞活性,加重組織及細胞壞死程度[4-5]。陳肖松等[1]將實驗兔傷肢放入海水浸泡3 h,傷后7 d通過電鏡掃描觀察海水浸泡骨損傷處,發(fā)現(xiàn)成骨細胞損傷嚴重,線粒體、細胞核溶解,細胞膜及核膜破壞。

火器傷的常規(guī)處理為早期徹底清創(chuàng),二期閉合傷口。但在野外海戰(zhàn)條件下清創(chuàng)后二期閉合傷口,傷病員往往住院時間長、康復時間長、并發(fā)癥多等,不符合軍人傷員快速歸隊的現(xiàn)實需求。同時,目前已有學者對一些局部軟組織損傷及污染輕的火器傷,早期徹底清創(chuàng)后一期閉合傷口,取得了滿意的療效[6-9]。Wright等[10]認為,骨折內固定能有效防治火器傷致骨折感染,降低感染的發(fā)生率。及時徹底的清創(chuàng)是預防感染發(fā)生的關鍵,本實驗中所有實驗兔傷口均獲得徹底清創(chuàng),HE染色中均未見炎性細胞。

在X線片及HE染色上可看出兩組實驗兔缺損處新骨形成隨著時間的延長逐漸增多,但相同時間點內,單純火器傷組形成的新骨要比海水浸泡火器傷組多,術后12周單純火器傷組骨缺損基本達到愈合,而海水浸泡火器傷組未達到骨性愈合。X線及HE染色表明,海水浸泡影響火器傷致兔股骨骨缺損愈合。林建寧等[11]研究表明,骨折經(jīng)過海水浸泡后,骨折愈合率明顯降低,最終導致骨折愈合延遲。

骨缺損的修復是一系列相關細胞活動有序進行的產(chǎn)物。首先,骨缺損處發(fā)生急性炎性反應,隨后出現(xiàn)肉芽組織浸潤,骨祖細胞聚集、增殖和分化,基質的形成和鈣化,最后骨修復完成。生物學信號、力學信號在骨缺損修復過程中起重要作用。VEGF和HIF-1α是促進骨折修復重要的細胞因子。VEGF是血管生成的調節(jié)因子,介導新血管生成,具有促進血管形成的作用[12]。新生血管的形成對骨折愈合極其重要,新生血管為骨折愈合提供營養(yǎng)及原料。HIF-1α可以通過2種方式促進骨缺損愈合,一種是直接調節(jié)骨系細胞功能,另一種是促進VEGF的表達[13]。此外,在低氧條件下,HIF-1α可以通過促進核心結合因子α1表達,間接激活間充質干細胞向成骨細胞方向分化,同時促進成骨細胞發(fā)育,最終促進骨缺損愈合[14]。通過PCR可以看出,海水浸泡火器傷組及單純火器傷組HIF-1α的表達均在造模后早期即開始逐漸升高,海水浸泡火器傷組升高較單純火器傷組更明顯。這與海水浸泡加重火器傷所致的局部低氧狀態(tài)有關。本實驗中在術后早期海水浸泡火器傷組VEGF表達低于單純火器傷組,說明海水浸泡影響VEGF的表達。這與海水浸泡嚴重損傷成骨細胞、骨祖細胞等細胞有關。同時陳肖松等[1]證明海水浸泡影響骨祖細胞、纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞等細胞VEGF的表達。

綜上所述,海水浸泡可能通過誘發(fā)原始成骨細胞出現(xiàn)變性、壞死,抑制斷端組織(包括骨祖細胞、纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞)的VEGF表達的途徑,導致火器傷所致骨缺損愈合延遲。