質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)分析篩選蒸餾酒特征物質(zhì)的研究

于佳佳，景加榮，薛 兵，王玉涵，李 飛

（1.上海裕達(dá)實業(yè)有限公司，上海 200240；2.上海衛(wèi)星裝備研究所，上海 200240）

蒸餾酒的乙醇濃度一般高于發(fā)酵產(chǎn)物，屬于酒精度數(shù)較高的烈性酒，其中酒精和水的含量高于90%[1]，制作過程主要為釀造、蒸餾、冷卻。世界六大蒸餾酒包括白酒、朗姆酒、金酒、白蘭地、伏特加和威士忌，不同蒸餾酒的生產(chǎn)工藝存在較大差別，例如白酒在發(fā)酵過程中淀粉轉(zhuǎn)化為糖和糖轉(zhuǎn)化為酒精同時進(jìn)行，而其他蒸餾酒（如威士忌和伏特加）淀粉轉(zhuǎn)化為糖和糖轉(zhuǎn)化為酒精接續(xù)發(fā)生，或者糖轉(zhuǎn)化為酒精單獨發(fā)生。白酒在生產(chǎn)過程中，蒸餾工藝大多是在固態(tài)下進(jìn)行[2]。威士忌主要有兩種類型：麥芽威士忌和谷物威士忌，多數(shù)品牌的威士忌是由多種單一麥芽威士忌和谷物威士忌混合而成[3]。白酒主要為谷類物質(zhì)（高粱、玉米、大米等）或者水果發(fā)酵形成，不同原料形成的白酒風(fēng)味不同[4]，主要包括醬香型酒、兼香型酒、清香型酒等，其中醬香型酒以茅臺為代表，口子窖屬于兼香型酒。蒸餾酒因發(fā)酵工藝會產(chǎn)生豐富的物質(zhì)成分，這些物質(zhì)影響蒸餾酒的風(fēng)味、存儲條件等[5]。目前針對這些物質(zhì)建立了許多前處理方法與分析手段。

常見的分析方法為光譜法，如紅外光譜[6-7]、紫外-可見光光譜[8]、熒光光譜[9]等；色譜法，如氣相色譜[10]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[11-12]等。為了更加精準(zhǔn)分析蒸餾酒中的物質(zhì)成分，對樣品處理方面進(jìn)行了大量的研究，形成多種前處理方法，如固相微萃取和攪拌吸附萃取[13-14]、液液萃取[15]等。在檢測設(shè)備方面，多種高性能檢測設(shè)備用于物質(zhì)分析，如二重氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備分析威士忌中的乙酯類物質(zhì)[16]；傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和液相色譜與質(zhì)譜串級區(qū)分兩類不同威士忌之間的主要差異[17]；氣相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析白酒的風(fēng)味物質(zhì)成分[18]等。通過開發(fā)新型前處理方法和提升檢測設(shè)備的性能，目前已獲得了大量的蒸餾酒主要物質(zhì)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息，截至2017 年已經(jīng)識別出的白酒物質(zhì)成分超過1800 種[19]，涵蓋有機(jī)酸類、酯類、醇類、醛類、酚類、雜環(huán)、萜烯和芳香族化合物等[20-23]，但這些物質(zhì)不可能全部用于鑒別不同種類酒的差異性。另外，已識別的物質(zhì)成分不可能涵蓋酒的全部風(fēng)味物質(zhì)。

大量研究主要集中在酒類風(fēng)味物質(zhì)的識別上，對簡化酒類差異性識別的研究較少，目前主要集中在同型酒的分類或特征物質(zhì)識別，如方差分析對不同品種紅葡萄酒的揮發(fā)性化合物的特征提取分析[24]；主成分分析（Principal components analysis，PCA）對多種威士忌進(jìn)行分類[25]；正交偏最小二乘法區(qū)分威士忌的類型（混合威士忌或單麥芽威士忌）[26]；聚類分析確認(rèn)不同啤酒之間的相似性[27]；偏最小二乘-判斷分析不同酒的產(chǎn)地[28]等。針對復(fù)雜多樣的數(shù)據(jù)，可以對數(shù)據(jù)信息進(jìn)行處理，縮小關(guān)注物質(zhì)的范圍。

本研究利用電噴霧離子源-質(zhì)譜儀直接進(jìn)樣對威士忌和白酒進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)成分測試，獲得掃描范圍內(nèi)所有物質(zhì)信息，利用多元分析方法對結(jié)果進(jìn)行處理，剔除品牌、年份影響的特征物質(zhì)，縮小特征物質(zhì)的關(guān)注范圍。通過主成分分析及其載荷圖篩選出具有差異性的物質(zhì)，利用熱圖驗證篩選結(jié)果的可靠性，再通過不飽和性[26]和范式圖[29]推算出差異性物質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)，建立一種直接質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)分析對蒸餾酒進(jìn)行差異性物質(zhì)篩選的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：威士忌選取TALISKER 威士忌（10 年）：單麥芽酒，英國；GLENKINCHIE 威士忌：單麥芽酒，蘇格蘭；HIBIKI 威士忌（21 年）：調(diào)和酒，日本。白酒選取茅臺酒（2010 年、2013 年）：醬香型，中國貴州仁懷市；口子窖（10 年型）：兼香型，中國安徽淮北市。

試劑：甲醇（色譜醇），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去離子水，自制；校正液與利血平，美國賽默飛世爾公司（Thermo Fisher）。

儀器設(shè)備：LTQ Orbitrap XL 質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)譜條件

正離子模式，電噴霧（ESI）離子源；傳輸線溫度275 ℃；LTQ 模式；噴霧電壓：4.0 kV；管狀透鏡電壓：125 V；樣品流速：20 μL/min；質(zhì)量掃描范圍：50～2000 u。

1.2.2 實驗步驟

質(zhì)譜儀使用前，先用利血平進(jìn)行調(diào)諧，用陰陽離子校正液進(jìn)行校正，保證儀器的結(jié)果準(zhǔn)確。實驗用100 μL 蒸餾酒樣品加入1∶1 的甲醇與水溶液中稀釋100 倍，取500 μL 樣品進(jìn)行測定，每個樣品測試5 次。樣品測試前需要進(jìn)甲醇-水溶液進(jìn)行清洗，減少實驗誤差。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

譜圖分析采用Xcalibur1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Thermo Fisher），數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖采用simca14.1 和Origin2018，PCA 分析采用simca14.1。范式圖利用Xcalibur1.2 進(jìn)行分析得到相對分子量下的可能化學(xué)式，對這些化學(xué)式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，元素選擇C、H、O、N、S，并計算O/C 和H/C，結(jié)果用Origin2018 作圖。分析時charge 設(shè)定為1，質(zhì)量偏差設(shè)置為10 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蒸餾酒的質(zhì)譜結(jié)果

針對不同蒸餾酒進(jìn)行質(zhì)譜測試，并篩選不同蒸餾酒的主要質(zhì)譜峰，ESI源是軟電離方式，得到的結(jié)果多為分子離子峰，這對實驗建立很有幫助[30]。通過全掃描方式獲得了6 種蒸餾酒的質(zhì)譜圖，識別出各種蒸餾酒的主要物質(zhì)成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單麥芽威士忌、混合威士忌、茅臺、口子窖四類蒸餾酒之間主要物質(zhì)存在明顯差異，考慮產(chǎn)地和年份因素，篩選單麥芽威士忌的特征峰3 種，混合威士忌特征峰4種，茅臺特征峰2種，口子窖特征峰4種。

具體結(jié)果如圖1 所示，其中a—c 為威士忌：（a）為TALISKER 威士忌，（b）為GLENKINCHIE 威士忌，（c）為HIBIKI 威士忌；d—f 為白酒：（d）為茅臺酒（2010 年），（e）為茅臺酒（2013 年），（f）為口子窖。根據(jù)原始譜圖發(fā)現(xiàn)，在m/z 介于50～100 u、500～2000 u 之間無質(zhì)譜峰出現(xiàn)（信噪比不大于3），因此，圖1 中橫坐標(biāo)范圍為100～500 u。TALISKER 主要質(zhì)譜峰在m/z=141[29]、m/z=197[29]、m/z=274[29]、m/z=318 和m/z=365[29]等；GLENKINCHIE 主要質(zhì)譜峰在m/z=203[29]、m/z=274[29]、m/z=302、m/z=318 和m/z=365[29]等；混合威士忌HIBIKI 主要質(zhì)譜峰在m/z=233[29]、m/z=261[29]、m/z=277[29]、m/z=321[29]等；2010年茅臺酒的主要質(zhì)譜峰在m/z=136[29]、m/z=141[29]、m/z=196[29]等；2013 年茅臺酒的主要質(zhì)譜峰在m/z=118[29]、m/z=136[29]、m/z=156[29]、m/z=197[29]、m/z=279、m/z=317 等。經(jīng)過整理發(fā)現(xiàn)，單麥芽威士忌酒的主要質(zhì)譜峰在m/z=274[29]、m/z=318 和m/z=365[29]，與混合威士忌的特征峰區(qū)別明顯；不同年份茅臺酒的主要質(zhì)譜峰在m/z=136[29]、m/z=196[29]；口子窖在m/z=118[29]、m/z=141[29]、m/z=156[29]、m/z=258等處均存在強(qiáng)質(zhì)譜峰，茅臺酒與口子窖的主要特征峰同樣存在明顯區(qū)別。

圖1 威士忌和白酒質(zhì)譜圖

2.2 統(tǒng)計學(xué)分析

將威士忌和白酒質(zhì)譜結(jié)果分別做PCA 分析，多數(shù)威士忌均能用2 個主成分因素代表，其中單一威士忌由于選取的產(chǎn)地不同而分散，但與混合威士忌有明顯的區(qū)分。茅臺酒因年份不同而分散，但與口子窖區(qū)分明顯。威士忌比白酒分散，主要原因在于白酒生產(chǎn)廠家相同，而威士忌來自不同國家，呈多元化，上述結(jié)論從質(zhì)譜結(jié)果的主要特征峰可以得到佐證。載荷圖與PCA 圖在布局上的結(jié)果具有相關(guān)性，圖中的點代表質(zhì)荷比，顏色代表區(qū)域內(nèi)點密度（Density），數(shù)值越高，區(qū)域內(nèi)點密度越大，點數(shù)越多。載荷圖顯示了不同質(zhì)荷比之間的相關(guān)性，相關(guān)性強(qiáng)的數(shù)據(jù)相近，相關(guān)性相反的數(shù)據(jù)分布在通過原點的線的兩端，p1和p2接近0的點不能分析。通過載荷圖可以進(jìn)一步篩選出各蒸餾酒主要特征峰中關(guān)聯(lián)性較高的特征物質(zhì)，其中單一威士忌的特征峰2 種（關(guān)聯(lián)性高），混合威士忌的特征峰2 種（關(guān)聯(lián)性高），白酒特征峰兩種（關(guān)聯(lián)性高）：茅臺的特征峰1種，口子窖的特征峰1種。

具體結(jié)果如圖2，圖2a為威士忌PCA分析結(jié)果，黑色（B）代表混合威士忌，白色（M）代表單一威士忌。圖2c為白酒PCA分析結(jié)果，黑色（K）代表口子窖，白色（M）代表茅臺。圖2b 和2d 為基于PCA 的載荷圖，2b為威士忌的載荷圖，2d為白酒的載荷圖，可以認(rèn)為威士忌在t[1]和t[2]軸兩端分布不明確，對應(yīng)散點圖中密度高區(qū)域較為集中，在pt[2]軸上，白酒中茅臺和口子窖明顯分布在t[2]軸兩端，對應(yīng)散點圖劃分兩個區(qū)域明顯，高密度點群分別在第一象限和第二象限中，并可以分別識別特征物質(zhì)[26]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)威士忌在0.2～0.4 密度范圍內(nèi)，存在m/z=277、m/z=321 和m/z=365 等質(zhì)譜峰，其中m/z=277和m/z=321 為混合威士忌的特征峰；在0.4～1 密度范圍內(nèi)存在m/z=274、m/z=318 且為單一威士忌的特征峰。白酒有0.2～0.8（p1：-0.025～-0.015，p2：-0.01～0.02）和0.2～1（p1：-0.005～0.015，p2：0.015～0.025）兩個高密度范圍，在0.2～0.8 密度范圍內(nèi)存在m/z=141、m/z=317 質(zhì)譜峰，且為茅臺的特征峰。在0.2～1 區(qū)域存在m/z=118、m/z=136、m/z=156、m/z=258 質(zhì)譜峰，其中m/z=118、m/z=156 為2013 年茅臺的特征峰，而m/z=136 為不同年份茅臺的特征峰，m/z=258為口子窖的特征峰。

圖2 兩類蒸餾酒的主成分分析及載荷圖

將相關(guān)性較高的6 種特征峰做熱圖，如圖3 所示，橫坐標(biāo)代表6 種主要特征峰的質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)代表6 種不同蒸餾酒，顏色反映了特征質(zhì)譜信號的相對強(qiáng)度大小，顏色越深，峰強(qiáng)越高，同一特征物質(zhì)在不同酒中的顏色差異越大，越能用于區(qū)分酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6 種特征峰在6 種蒸餾酒中的含量差異較大，說明通過PCA結(jié)合散點圖篩選可靠。

圖3 強(qiáng)相關(guān)性特征物質(zhì)熱圖

2.3 特征物質(zhì)結(jié)構(gòu)可視化分析

直接對全掃描結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，數(shù)據(jù)量龐大且無重點，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析困難。范式圖中存在一個特殊點，可以用來數(shù)據(jù)分析，即在O/C=0.5，H/C=1 處存在一個中心，經(jīng)過該中心存在4 條特殊直線，H/C=-2(O/C)+2，O/C=0.5，H/C=2(O/C)，H/C=1，這4 條線分別代表甲基或去甲基化，氫化或脫氫過程，水合作用和脫水過程，氧化過程或還原過程，經(jīng)過線的點會發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)，中心點發(fā)生4 種反應(yīng)[31]。如圖4 所示，圖中a—d 分別代表單一麥芽威士忌、混合威士忌、茅臺和口子窖，圖中橫坐標(biāo)代表碳元素與氧元素個數(shù)比，縱坐標(biāo)為氫元素和碳元素個數(shù)比，顏色代表質(zhì)荷比，質(zhì)荷比越大，顏色越深。對比4 張圖發(fā)現(xiàn)，單一麥芽威士忌、混合威士忌、茅臺中心點比較明顯，口子窖該坐標(biāo)不存在物質(zhì)。經(jīng)分析單一麥芽威士忌中心點分子式為C2H2OS4（m/z=171），混合威士忌中心點分子式為C4H4O2S4（m/z=212），茅臺中心點分子式為C2H2OS3（m/z=138），這3 個結(jié)構(gòu)均不是蒸餾酒的主要特征物質(zhì)，通過全掃描范式圖不能直接識別出威士忌和白酒的差異性物質(zhì)。

圖4 4種蒸餾酒的范式圖

將PCA 與載荷圖分析結(jié)果得到的六種強(qiáng)相關(guān)性特征物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，得到相應(yīng)的范式圖，如圖5 所示，H/C 和O/C 值在不同范圍內(nèi)代表的物質(zhì)種類不同[31]，如A 區(qū)代表脂肪酸或者酯類，B 區(qū)代表苦味酸及其衍生物，這些為發(fā)酵的產(chǎn)物[11]。圖5中不同形狀標(biāo)記元素組成不同，包括CHO、CHON、CHONS 3種不同元素組成形式，不同顏色標(biāo)記的相對分子量不同，灰色代表m/z=136、紅色代表m/z=258、藍(lán)色代表m/z=274、綠色代表m/z=277、紫色代表m/z=318、黃色代表m/z=321。通過篩選在A、B 區(qū)域內(nèi)的可能結(jié)構(gòu)得到6 種主要特征物質(zhì)的可能化學(xué)式信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m/z=136 化學(xué)式可能為C8H8O2、C9H12O、C2H4N2O5、C4H12N2OS 等。m/z=258化學(xué)式可能為C14H26O4、C11H6N4O4、C11H18N2O3S，m/z=274 化學(xué)式可能為C14H26O5、C17H22O3、C18H26O2等，m/z=277 化學(xué)式可能為C5H7N7O7、C14H31NO2S等，m/z=318 化學(xué)式可能為C8H6N4O10、C17H22N2O2S，m/z=321 化學(xué)式可能為C19H31NOS。對物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析可以采用質(zhì)譜串級結(jié)合數(shù)據(jù)分析進(jìn)行，本實驗中未進(jìn)行相關(guān)實驗，重點關(guān)注了對質(zhì)譜全掃描結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)分析進(jìn)行物質(zhì)差異識別的方法。

圖5 強(qiáng)相關(guān)性特征物質(zhì)范式圖

3 結(jié)論

本研究建立的方法可以有效區(qū)分不同類別蒸餾酒之間的差異性物質(zhì)。通過全掃描獲得主要特征峰，去除受不同廠家、年份影響的數(shù)據(jù)，通過PCA結(jié)合載荷圖分析，篩選出相關(guān)性高的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步縮小特征物質(zhì)識別范圍，最后通過范式圖推斷特征物質(zhì)分子離子峰和物質(zhì)可能存在的結(jié)構(gòu)。通過本方法，可以有效減少差異性物質(zhì)的識別數(shù)量，降低工作量，且物質(zhì)識別與分析不會局限在已識別的物質(zhì)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中。對成分種類較多的物質(zhì)識別提供新的可行性，對未被了解掌握的自然物質(zhì)的分析起到輔助作用，同時對復(fù)雜自然物質(zhì)成分篩選提供新思路。本研究建立的方法與傳統(tǒng)分子離子串級分析的目的一致，用于推斷物質(zhì)化學(xué)式。區(qū)別在于本研究通過確認(rèn)元素組成與不飽和鍵的數(shù)量可以直接推斷物質(zhì)結(jié)構(gòu)，而串級結(jié)構(gòu)分析通過研究分子離子信息、碎片離子信息以及兩者之間的關(guān)系推斷物質(zhì)結(jié)果，推算過程復(fù)雜。本研究在實驗上只需對待測物進(jìn)行全掃描，無需串級分析，大量減少了碰撞氣的消耗。