低頻低強(qiáng)度超聲場(chǎng)中玻璃微管機(jī)械作用研究

王婷婷　丁孝宇　張淙悅　傅舒嫻　鄭政

摘要：玻璃微管電極是迄今為止記錄神經(jīng)元微弱電信號(hào)最精密的工具，目前已有許多學(xué)者將其應(yīng)用在超聲神經(jīng)刺激研究領(lǐng)域，但其適用性卻還未得到檢驗(yàn)。通過(guò)粒子沖擊試驗(yàn)研究了玻璃微管尖端的液體流動(dòng)，發(fā)現(xiàn)頻率為 500 kHz 的低強(qiáng)度超聲脈沖能在其尖端激發(fā)出強(qiáng)烈的尖銳邊緣聲流，且聲流的影響范圍達(dá)到數(shù)百微米；并利用光學(xué)顯微圖像研究了超聲引起的玻璃微管尖端的橫向振動(dòng)，發(fā)現(xiàn)尖玻璃微管尖端產(chǎn)生的橫向振動(dòng)幅度也可達(dá)到微米量級(jí)。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用傳統(tǒng)的玻璃微電極作為超聲神經(jīng)刺激的記錄工具可能會(huì)對(duì)被研究的神經(jīng)組織帶來(lái)額外的機(jī)械刺激，從而嚴(yán)重干擾超聲刺激的試驗(yàn)結(jié)果。

關(guān)鍵詞：超聲神經(jīng)刺激；玻璃微管；尖銳邊緣聲流；橫向振動(dòng)

中圖分類號(hào)：R 331??????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Mechanical effect of glass micropipettes in low-frequency low-intensity ultrasonic field

WANG Tingting， DING Xiaoyu， ZHANG Congyue， FU Shuxian， ZHENG Zheng

（School ofHealth Science and Engineering， University of Shanghaifor Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： The glass microelectrode is the most precise tool for recording the weak electrical signals of neurons by far. At present， it has been widely used in the field of ultrasound neuronal stimulation research， but theapplicabilityof glass microelectrodes has not been tested. The particle impacting experiment was used to study the liquid flow at the glass micropipette tips. It was found that low- intensityultrasoundpulsewithafrequencyof 500 kHzcanevokeastrongsharp-edgeacoustic streaming at the glass micropipette tips， and the influence range of acoustic streaming reaches hundreds of microns. The transverse vibration of the glass micropipette tips caused by the ultrasound was studied by optical microscope image， and it was found that the amplitude of the transverse vibration of the sharp glass micropipette tips can also reach the order of micrometers. The experimental results indicate that if the traditional glass microelectrodes are used as a recording tool for ultrasound neuronal stimulation， it may bringadditional mechanicalstimulation to the nerve tissue understudy， which willseriously interfere with the experimental results of ultrasound stimulation.

Keywords： ultrasound neuronal stimulation; glass micropipette; sharp-edge acoustic streaming;transverse vibration

2008年， Tyler 等[1]使用熒光染料首次在小鼠海馬 CA1神經(jīng)元胞體中記錄到了由低頻低強(qiáng)度超聲脈沖（頻率440 kHz，聲強(qiáng)2.9 W/cm2）激發(fā)出來(lái)的 TTX 敏感鈉離子通道開(kāi)放以及突觸鈣離子內(nèi)流的信號(hào)[1]。由于超聲波是一種機(jī)械波，具有和電流完全不同的物理性質(zhì)，其神經(jīng)刺激作用無(wú)法用已有的理論解釋，因此成為一個(gè)十分重要的科學(xué)問(wèn)題。

研究神經(jīng)系統(tǒng)離不開(kāi)對(duì)其離子通道活動(dòng)及其由此帶來(lái)的微弱電信號(hào)的測(cè)量和記錄，但由于超聲波的特殊性，傳統(tǒng)的神經(jīng)電生理記錄工具是否仍然適用也需要重新檢驗(yàn)。用硼硅酸鹽玻璃管加熱拉制的玻璃微管電極或稱為玻璃微電極無(wú)疑是迄今為止研究神經(jīng)元微弱電信號(hào)的最通用和最精密的工具，近些年來(lái)也確實(shí)有不少學(xué)者在超聲刺激研究中使用玻璃微電極來(lái)記錄神經(jīng)電信號(hào)[2-7]。在使用玻璃微管（簡(jiǎn)稱微管）記錄時(shí)，研究者們通常默認(rèn)其僅僅是作為一個(gè)被動(dòng)的傳感器而存在，其本身并不會(huì)對(duì)神經(jīng)組織產(chǎn)生額外的刺激。然而在超聲刺激領(lǐng)域，這個(gè)假設(shè)卻從未得到檢驗(yàn)。

在超聲場(chǎng)中的一切物質(zhì)都受到超聲波的作用，如果對(duì)支配物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的微分方程作一階近似，可以看到超聲的聲學(xué)作用，但是，如果考慮到其非線性成分，則機(jī)械作用就得以顯現(xiàn)。超聲最顯著的非線性作用是聲輻射力和聲流[8-12]，在玻璃和水這樣存在巨大聲阻抗差異的固液界面上，這兩種非線性效應(yīng)都會(huì)很明顯。如果超聲激發(fā)了玻璃微管的機(jī)械作用，那么，這種作用的強(qiáng)度和作用范圍就必須得到充分的研究，從而為評(píng)估這一研究工具的適用性提供基本信息。

本文研究了在頻率為500 kHz 的低強(qiáng)度超聲脈沖下兩種典型的玻璃微管（尖微管和粗微管）尖端上產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)，試驗(yàn)的初步結(jié)果顯示：聲壓在54～400 kPa之間的超聲波在兩種微管尖端均能激發(fā)出明顯的噴射樣聲流，影響范圍可達(dá)幾百微米；并且在尖玻璃微管尖端還能觀察到幅度達(dá)微米量級(jí)的機(jī)械振動(dòng)。

1試驗(yàn)

1.1記錄槽和超聲換能器

試驗(yàn)中使用的記錄槽需要將定量的超聲能量傳遞到觀察區(qū)域。本文設(shè)計(jì)并用3D 打印工藝制作了一個(gè)記錄槽，如圖1（a）所示，記錄槽的左側(cè)側(cè)壁固定了一個(gè)帶有耦合錐的聚焦超聲換能器，右側(cè)側(cè)壁前方用吸聲材料遮住。記錄槽下半部澆鑄0.4%的瓊脂糖，瓊脂糖的上表面和換能器軸線齊平，剩下的空間注入去離子水（需沒(méi)過(guò)耦合錐開(kāi)口，水位保持在比換能器軸線高4～5 mm 的位置）。記錄槽底部中央嵌有一個(gè)20×10 mm2的玻璃窗，透射式顯微鏡的光源從這里入射，穿過(guò)透明的傳聲媒質(zhì)照亮被觀察的玻璃微管尖端。由于瓊脂糖中的含水量達(dá)99.6%，其聲學(xué)特性和水的聲學(xué)特性非常接近[13]，所以，瓊脂糖對(duì)記錄槽中的聲場(chǎng)影響幾乎可以忽略不記。當(dāng)聚焦超聲換能器工作時(shí)，在媒質(zhì)中傳播的是一個(gè)近似的平面行波。

如圖1（b）所示，聚焦超聲換能器由壓電晶片、背襯和聚焦透鏡組成。壓電晶片是一個(gè)直徑20 mm、厚度4 mm 的 PZT4圓形振子，背襯使用Epo-tek 301樹脂和鎢粉按照一定比例混合而成[14]，厚度為10 mm。在匹配層前方用環(huán)氧樹脂粘接一個(gè)3D 打印制成的聚焦透鏡，其中心厚度為1/4波長(zhǎng)。耦合錐外殼也由3D 打印制成，其內(nèi)部灌注 PDMS（聚二甲基硅氧烷， Polydimethylsiloxane）， PDMS 固化后既用作超聲傳播媒質(zhì)，也將耦合錐外殼和換能器前方的透鏡粘接成一體。換能器制作完成后用水聽(tīng)器（型號(hào) Onda HNR-0500）在一個(gè)消除了聲反射的大水槽中進(jìn)行聲場(chǎng)測(cè)試。超聲換能器由一個(gè)自制的正弦脈沖發(fā)生器驅(qū)動(dòng)[15]，該發(fā)生器的包絡(luò)波形可在很大范圍內(nèi)調(diào)整。驅(qū)動(dòng)電路的末級(jí)采用了高效小巧的 E 類功放[16]，通過(guò)改變其電源電壓，控制試驗(yàn)中玻璃微管尖端所在位置（圖1（a）中的 O（0，0）處，與換能器相距10 mm ）的超聲峰值聲壓可在54～400 kPa 間連續(xù)調(diào)節(jié)。聲壓標(biāo)定也在聲場(chǎng)測(cè)試過(guò)程中完成，換能器測(cè)試完成后與記錄槽裝配到一起。

1.2玻璃微管

研究了2種玻璃微管，都用硼硅酸鹽玻璃管（BF 120-69-10）在拉制儀 P-97（Sutter Instrument， Novato， USA）上拉制。一種按照 Sutter 推薦的胞內(nèi)電極（尖微管）方案拉制，程序設(shè)定為 Heat=531， Pull=60， Velocity=80， Delay=70， Pressure=500。另一種按照膜片鉗電極（粗微管）方案拉制，程序設(shè)定為 Heat=531，Pull=0，Velocity=20，Time=250， Pressure=500。其中： Heat 表示鉑絲的電流值，此值由測(cè)試得到； Pull 為玻璃管軟化之后引入的拉力； Velocity 為玻璃管第一次開(kāi)始熔化時(shí)的分離速度； Time 為拉動(dòng)玻璃時(shí)用于冷卻鉑絲和玻璃管的時(shí)間； Delay 表示另一種冷卻模式，其冷卻時(shí)間（300 ms）比 Time 模式（最長(zhǎng)127.5 ms）更長(zhǎng)；Pressure 為冷卻鉑絲和玻璃管的壓力。如圖2所示，尖微管具有細(xì)長(zhǎng)的頸部，錐度約5°，其尖端直徑在水鏡下難以分辨，可能在亞微米量級(jí)。粗微管頸部短粗，錐度約20°，尖端直徑1～3μm。試驗(yàn)時(shí)微管內(nèi)充灌去離子水。

1.3玻璃微管的機(jī)械效應(yīng)觀察

采用攝影法（攝像機(jī)型號(hào) HT630BN，分辨率為1536×1024）估計(jì)玻璃微管尖端的振動(dòng)幅度，在對(duì)焦清楚的情況下，如果視頻出現(xiàn)模糊必然是電極振動(dòng)引起的。模糊尖端圖像邊緣之間的距離作為電極尖端振動(dòng)的幅度。觀察振動(dòng)使用水浸式物鏡，分辨能力約為1μm。

觀察聲流最常用的方法是粒子圖像測(cè)速法（PIV）[12，17-21]，該方法可以揭示一定范圍內(nèi)聲流的全貌并進(jìn)行流速分布的定量測(cè)量。但是，這一方法所要求的試驗(yàn)設(shè)備比較復(fù)雜，難以用于本試驗(yàn)所使用的特定的記錄槽中。因此，設(shè)計(jì)了粒子沖擊試驗(yàn)，雖然這個(gè)方法不能提供流速分布的定量數(shù)據(jù)，但卻能直觀地顯示微流對(duì)電極尖端前方物質(zhì)的沖擊效果。

試驗(yàn)采用市售的沸石粉作為指示粒子觀察聲流。將20 mg 沸石粉加入3 mL 去離子水中，攪拌均勻并將其全部注入已澆筑瓊脂糖的記錄槽中。約15 min 后沸石粉幾乎完全沉積到瓊脂糖表面形成一層薄的微粒層。將顯微鏡先對(duì)焦到粒子層表面，然后將物鏡上調(diào)50μm，并使用微電極操縱器將微管尖端推進(jìn)到顯微鏡焦面，使其尖端顯示最清晰，此時(shí)電極尖端應(yīng)在粒子層上方約50μm 處。如果有液流從微管尖端流向前方，就會(huì)干擾尖端下方的微粒并留下擾動(dòng)痕跡。在記錄槽上方蓋上一片1 mm 厚的載玻片，載玻片和記錄槽中的水相接，用以消除由超聲場(chǎng)邊緣在水面上可能引起的漣漪。

觀察微管機(jī)械效應(yīng)時(shí)施加的超聲脈沖寬度均為500 ms。在觀察聲流時(shí)，需要在下一次施加超聲脈沖前至少等待1 min，以使受到干擾的粒子完全穩(wěn)定。

2結(jié)果與討論

2.1玻璃微管尖端激發(fā)的聲流

將顯微鏡聚焦到粒子層表面，由于粒子層對(duì)光的阻擋，未施加超聲前視野里是基本均勻的暗色。用微操縱器將充灌好去離子水的微管尖端移到記錄槽中央（距離換能器10 mm）位置，電極與超聲換能器軸線垂直，與液面成35°。施加超聲脈沖時(shí)玻璃微管尖端下方立刻出現(xiàn)一個(gè)亮度增加的區(qū)域，并隨著超聲持續(xù)而擴(kuò)大，亮斑周邊產(chǎn)生一圈灰度加深的區(qū)域，并伴有黑色霧狀物擴(kuò)散。超聲結(jié)束后黑色的霧狀物迅速回落，亮斑周邊的黑圈減弱，亮斑收縮變暗。圖3（a）顯示了300 kPa 超聲脈沖作用下粗玻璃電極尖端下方亮斑形成和回縮的過(guò)程。圖3（a）中 A 圖是未施加超聲時(shí)的粗微管尖端和沸石粉， B 圖是超聲脈沖施加過(guò)程中的圖像， C 圖是超聲結(jié)束后100 ms的圖像。

采用人工作圖法來(lái)估計(jì)玻璃微管尖端到尖端前方亮斑邊緣之間的距離 L，并以此表示電極激發(fā)的聲流強(qiáng)度。將不同聲壓下尖玻璃微管和粗玻璃微管的距離 L 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖，如圖3（b）所示。從圖中能明顯看出，聲流強(qiáng)度和聲壓強(qiáng)度成正相關(guān)。當(dāng)聲壓小于等于200 kPa 時(shí)尖玻璃微管和粗玻璃微管激發(fā)的聲流強(qiáng)度沒(méi)有明顯區(qū)別。但聲壓大于200 kPa后，在相同聲壓下粗微管激發(fā)的聲流強(qiáng)度明顯大于尖微管，而且聲壓越大，差別也越大，影響范圍可達(dá)到數(shù)百微米左右。

由于沸石粉（帶有一定雜質(zhì)）是不透明的，粒子層越厚，攝像機(jī)像素越黑，所以，圖像區(qū)域增亮或變暗必是微粒層減薄或增厚造成的。整個(gè)過(guò)程顯示超聲作用下有一個(gè)液流從微管尖端發(fā)出并快速作用到微粒層，將其下方的微粒推向周邊并堆積起來(lái)，中間區(qū)域微粒減少?gòu)亩纬闪涟撸苓吜Ｗ佣逊e形成黑圈，粒子中最細(xì)小的粒子被液流帶來(lái)的沖擊力推離微粒層并漂浮在液體中形成了黑霧。此過(guò)程完全符合噴射狀聲流的特征，看到的就像是俯瞰炸彈在地面爆炸，亮斑及其周邊黑圈像是彈坑，亮斑邊緣的放射狀圖像顯示了液流的形狀。無(wú)論是尖微管還是粗微管，超聲都會(huì)在其尖端激發(fā)出噴射樣聲流，沖擊其下方的沸石粉粒子。如果用亮斑寬度 L 表示聲流強(qiáng)度，將不同聲壓下的聲流強(qiáng)度和聲壓的關(guān)系用曲線表示，如圖3（b）所示，可以明顯看到兩者呈明顯的正相關(guān)，尖微管和粗微管尖端的聲流對(duì)粒子層沖擊的形式和過(guò)程基本一致，但是，聲流強(qiáng)度有明顯的區(qū)別。施加超聲脈沖的過(guò)程中，除微管尖端下方的亮斑以外還出現(xiàn)了微弱的魚鱗狀亮斑，這種亮斑在整個(gè)顯微鏡視野中均勻存在，且亮度與聲壓正相關(guān)。試驗(yàn)表明，這種魚鱗狀亮斑即使無(wú)電極存在也會(huì)產(chǎn)生，可能是超聲輻射力直接作用于粒子層的結(jié)果。

近年來(lái)，微流體領(lǐng)域的研究者們發(fā)現(xiàn)，尖銳的結(jié)構(gòu)在超聲波作用下可以激發(fā)出強(qiáng)烈的聲流，稱為尖銳邊緣聲流（sharp-edge acoustic streaming）[22-25]。結(jié)構(gòu)越尖銳，激發(fā)的聲流流速越大，最大可達(dá)到超聲振動(dòng)速度的數(shù)量級(jí)。以往的研究表明，只要尖銳邊緣的局部曲率小于或接近黏滯性界面厚度6，尖端邊緣便可以激發(fā)出聲流。

式中：ν為溶液的運(yùn)動(dòng)黏度；ω為角頻率[24， 26]。

玻璃微管在拉制時(shí)是被機(jī)械力強(qiáng)制拉開(kāi)的，在其尖端形成了垂直于其軸線的環(huán)形橫截面。微管的外壁終止于環(huán)的外圓，內(nèi)壁終止于內(nèi)圓。相交線處的局部曲率半徑遠(yuǎn)小于尖端的外徑，形成銳度很小的鋒利邊緣。根據(jù)玻璃微管的電子顯微鏡照片[27]，估計(jì)局部曲率半徑可比外徑小一個(gè)數(shù)量級(jí)。試驗(yàn)中使用的粗玻璃微管的尖端外徑為1～3μm，尖玻璃微管外徑小于1μm，因此，截面局部曲率半徑可小至0.1μm或更小。由于本文使用的超聲頻率為500 kHz，計(jì)算得出6值在0.8μm 左右，可以看出，尖端的銳度比這個(gè)值小得多，提示微管尖端下方粒子層的擾動(dòng)是由其尖端激發(fā)的尖銳邊緣聲流引起的。

2.2玻璃微管尖端振動(dòng)

作者還在上述聚焦超聲換能器所產(chǎn)生的聲場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)了尖玻璃微管尖端的橫向振動(dòng)。調(diào)整顯微鏡的焦距使電極尖端清晰成像，施加超聲脈沖后電極尖端立刻變得模糊，超聲停止后又恢復(fù)清晰。很明顯這種模糊是由于電極尖端的反復(fù)高速?gòu)澢斐傻??？梢钥吹郊舛四：膮^(qū)域基本上以電極軸線為中心，兩側(cè)對(duì)稱，如圖4（a）所示。取尖端模糊區(qū)兩側(cè)邊緣間距作為其振動(dòng)幅度（圖4（a）黃色箭頭表示的距離為振動(dòng)幅度），對(duì)5根以相同條件拉制的尖玻璃微管進(jìn)行測(cè)量并取均值，發(fā)現(xiàn)在54～400 kPa 聲壓范圍內(nèi)振動(dòng)幅度和聲壓成正比，如圖5所示，當(dāng)聲壓為54 kPa 時(shí)振動(dòng)幅度約為1μm ，400 kPa 時(shí)可高達(dá)約6μm。振動(dòng)幅度和聲壓的關(guān)系可表示為A =0：53+0：15P，其中， A 為振動(dòng)幅度， P 為超聲聲壓。

在試驗(yàn)中，作用在微管上的聲輻射力與電極相互垂直。玻璃微管的桿部通過(guò)電極支架固定，形成一個(gè)微型懸臂梁，微管尖端是懸臂梁的自由端，對(duì)橫向作用力非常敏感。理論分析表明，懸臂梁可在連續(xù)分布的載荷作用下產(chǎn)生橫向振動(dòng)。雖然可能同時(shí)存在多種振動(dòng)模式，但自由端的振幅總是最大的[28]。尖微管有一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的頸部，與粗微管相比更容易產(chǎn)生振動(dòng)。

理論上，懸臂梁的振動(dòng)幅值與受力成正比，因此，應(yīng)該與聲壓呈平方律關(guān)系[29]。然而，試驗(yàn)結(jié)果表明，尖玻璃電極的振動(dòng)幅度與聲壓大致呈線性關(guān)系。這可能是由于液體中的黏性阻力造成的。當(dāng)電極的振幅越大、振動(dòng)速度越快時(shí)，電極受到的阻力越大，從而減小可能的振幅。與此相對(duì)的，在相同的試驗(yàn)條件下，粗玻璃微管的振動(dòng)卻難以觀察到振動(dòng)，如圖4（b）所示，即使聲壓達(dá)到400 kPa ，微電極尖端的清晰度仍無(wú)明顯變化，但這并不意味著它們是完全靜止的，有可能是振動(dòng)幅度太小而無(wú)法使用現(xiàn)有的觀察設(shè)備觀察到。

3結(jié)論

研究表明，低頻低強(qiáng)度超聲可以在玻璃微管尖端激發(fā)出強(qiáng)烈的聲流，這種聲流的作用范圍隨聲壓增加而增加，在聲壓為400 kPa 的條件下，尖微管激發(fā)的聲流作用范圍可達(dá)200μm，而粗微管的作用范圍可高達(dá)400μm。即使在54 kPa 這樣的極小聲壓下，聲流范圍也在15μm 左右。另外，微管振動(dòng)試驗(yàn)還在尖微管的尖端發(fā)現(xiàn)了微米數(shù)量級(jí)的橫向振動(dòng)。

在神經(jīng)電生理試驗(yàn)中，電極尖端需要精密接觸細(xì)胞膜才能精確記錄細(xì)胞電信號(hào)，尖電極更是可能刺穿細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)記錄。神經(jīng)細(xì)胞的直徑通常在10～40μm，電極尖端微米級(jí)的機(jī)械擾動(dòng)都有可能使試驗(yàn)得不到穩(wěn)定的記錄。更加重要的是強(qiáng)烈的聲流和振動(dòng)有可能給被研究的神經(jīng)組織帶來(lái)額外的機(jī)械刺激，嚴(yán)重干擾超聲刺激的試驗(yàn)結(jié)果。

本文僅在500 kHz這個(gè)頻率點(diǎn)上觀察了超聲波在玻璃微管尖端引起的機(jī)械作用，就低強(qiáng)超聲刺激的研究來(lái)說(shuō)，其涉及的頻率范圍遠(yuǎn)不止于此，在 MHz 級(jí)甚至10 MHz 級(jí)的頻率范圍里超聲引起的機(jī)械作用仍然未知。研究表明，無(wú)論超聲刺激研究所用的超聲頻率、強(qiáng)度為多大，如果擬使用玻璃微電極作為記錄工具，那么，事先研究超聲在其尖端引起的機(jī)械作用，評(píng)估這種機(jī)械作用對(duì)神經(jīng)的刺激將是試驗(yàn)可靠性的先決條件。

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（編輯：石瑛）