雪茄煙根腐病與土壤真菌群落和理化性狀的相關(guān)性分析

樊俊　譚軍　向必坤　施河麗　王瑞　譚紹安　肖亮　王雪松

摘要：為了解雪茄煙鐮刀菌（Fusarium ）根腐病與土壤真菌群落及理化性狀的關(guān)系，采用調(diào)查取樣的方法，研究了湖北來鳳縣雪茄煙根腐病發(fā)病與未發(fā)病區(qū)域的根際土壤真菌群落多樣性、土壤理化性狀及其與病情指數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明，相較于未發(fā)病根際土壤，根腐病發(fā)病減少了根際土壤真菌 Observed_species 、Shannon 、Simpson、Chao1、Ace 指數(shù)和擬本森頓酵母菌（Pseudobensingtonia）相對豐度，增加了鐮刀菌（Fusarium ）相對豐度。根腐病病情指數(shù)與土壤含水量、毛管孔隙度、速效鉀和 Fusarium 相對豐度呈顯著正相關(guān)（p<0.05）；與土壤通氣孔隙度和 Pseudobensingtonia 相對豐度呈極顯著負相關(guān)（p<0.01）。典型相關(guān)分析表明，毛管孔隙度和通氣孔隙度是影響雪茄煙根腐病發(fā)生的主要土壤因子。綜合來看，降低土壤毛管孔隙度和Fusarium 相對豐度、提高土壤通氣孔隙度和Pseudobensingtonia 相對豐度有利于防控雪茄煙鐮刀菌根腐病的發(fā)生。關(guān)鍵詞：雪茄煙；鐮刀菌根腐??；真菌；理化性狀；相關(guān)性分析

中圖分類號： S435.72?????????? 文獻標識碼： A?????????? 文章編號：1007-5119（2023）01-0100-07

Correlation Analysis between Cigar Root Rot and Fungal Community， Physical and Chemical Properties of Soil

FAN Jun， TAN Jun， XIANG Bikun*， SHI Heli， WANG Rui， TAN Shaoan， XIAO Liang， WANG Xuesong

（Enshi Branch Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： In order to understand the relationship between the occurrence of cigar Fusarium root rot and soil factors， we studied the soil fungi diversity and structural composition， physical and chemical properties and their relationship in Laifeng cigar producing areas with occurrence of cigar root rot. The results indicated that compared with uninfected control， the occurrence of cigar root rot caused? reduction? in? the? number? of fungal? species，? decreased? Shannon，? Simpson，? Chao1，? and? Ace? indexed? and? lower? relative abundance of Pseudobensingtonia and increased relative abundance of Fusarium in the rhizosphere soil. The disease index of root rot was significantly positively correlated with soil water content， capillary porosity， available potassium and the relative abundance of Fusarium （p<0.05）， and negatively correlated with soil aeration porosity and the relative abundance of Pseudobensingtonia （p<0.01）. Canonical correlation analysis showed that that soil capillary porosity and aeration porosity were the main soil factors affecting the occurrence of cigar Fusarium root rot. Overall， reducing soil capillary porosity and the relative abundance of Fusarium， increasing soil aeration porosity and the relative abundance of Pseudobensingtonia were conducive to the prevention and control of cigar Fusarium root rot.

Keywords： cigar; Fusarium root rot; fungus; physical and chemical properties; correlation analysis

鐮刀菌（Fusarium spp.）是一種在自然界廣泛分布的土傳真菌類病原菌，可侵染多種植物，導致植株根腐、莖腐、穗爛等[1-2]，在我國云南、河南等煙區(qū)普遍發(fā)生[3-4]，嚴重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量。近些年，隨著雪茄煙種植規(guī)模的不斷擴大，根腐病給雪茄煙造成的損失逐漸受到人們的關(guān)注[5]。

土壤-微生物-作物系統(tǒng)失調(diào)產(chǎn)生的土壤生態(tài)環(huán)境惡化、微生物區(qū)系失衡、植物抗病能力降低是煙草病害發(fā)生的主要因素[6]。有研究認為煙草鐮刀菌根腐病的發(fā)生主要受濕度、溫度和土壤 pH 的影響[7]，土壤含水量過高，發(fā)病較重。MEYER 等[8]研究表明土壤 pH 對根腐病發(fā)病有重要影響，pH 高于5.6有利于病害的發(fā)生和蔓延，pH 低于5.2時則很少發(fā)病。當前關(guān)于煙草根腐病影響因素的研究多集中在烤煙區(qū)的氣候及栽培模式[9]、防控措施[10]等方面，關(guān)于雪茄煙鐮刀菌根腐病病情指數(shù)與土壤真菌群落和理化性狀的相關(guān)性研究鮮有報道。為此，本文通過對根際土壤真菌擴增子測序和土壤理化指標分析，研究來鳳縣雪茄煙區(qū)鐮刀菌根腐病發(fā)病與未發(fā)病根際土壤真菌群落和土壤因子的差異及其與病情指數(shù)的相關(guān)性，以期明確影響根腐病發(fā)生的關(guān)鍵因素，為當?shù)匮┣褵煾〉姆揽靥峁├碚撘罁?jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集與制備

取樣地點為湖北來鳳縣漫水鄉(xiāng)桶子村、百福司鎮(zhèn)攔河村等雪茄煙葉種植區(qū)域。土壤類型為黃棕壤，肥力水平中等，雪茄煙品種為 CX80。在2021年9—10月雪茄煙葉采收結(jié)束后，在相同發(fā)病程度的煙株壟體中間去除1～2 cm 表層土后，進行環(huán)刀樣采集[11]，用于土壤物理指標測定；并拔出煙株莖稈及根系，采用抖動法采集鐮刀菌根腐病發(fā)病和未發(fā)病根際土壤，用于土壤化學性狀測定和真菌 ITS1測序。根腐病發(fā)病等級參考國家標準 GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》調(diào)查確定。病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×該級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100。采集未發(fā)病土壤樣品10個，用 SH 表示；發(fā)病土壤樣品10個，用 SD 表示。

1.2土壤理化性狀測定項目與方法

土壤 pH、有機質(zhì)（SOC）、堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）、有效氯（ACl）、交換性鈣（ECa）、交換性鎂（EMg）、有效硼（AB）、有效銅（ACu）、有效鉬（AMo）、有效鋅（AZn）、有效錳（AMn）、有效鐵（AFe）等參考鮑士旦[12] 的方法進行測定。土壤容重（SBD）、含水量（SAWC）、總孔隙度（STP）、毛管孔隙度（SCM）、通氣孔隙度（SAP）采用環(huán)刀烘干法測定[13]。

1.3土壤真菌的檢測

采用CTAB 法對樣本的基因組DNA 進行提取，再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的純度和濃度，取適量樣品，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。利用 ITS5-1737F （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′）和 ITS2-2043R （5′-GCTGCGTTCTTCA TCGATGC-3′）引物對土壤真菌 ITS1區(qū)進行 PCR （Bio-rad? T100梯度 PCR 儀）擴增。擴增體系為30μL：15μL Phusion Master Mix （2×）、3μL 的 Primer （2μmol/L ）、10μL 的 gDNA（1 ng/μL）、2μL的 H2O。反應(yīng)程序：98 C預(yù)變性1 min；98 C 10 s，50 C 30 s，72 C 30 s，30個循環(huán)；72 C，5 min 。擴增后的 PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。使用 New England Biolabs 公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司使用 HiSeq 進行上機測序[14]。

1.4數(shù)據(jù)分析

對相似度≥97%的序列進行 OTUs 的聚類，對聚類的序列開展物種的注釋，用 Mothur 軟件與 SILVA 的 SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進行物種的注釋分析。對 OTU 表中各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，用 Origin8.5軟件繪制稀釋曲線，用軟件 Qiime Version 1.9.0對 Alpha 多樣性進行分析，Shannon 指數(shù)和 Simpson 數(shù)越大表示群落多樣性越高， Observed_species、Ace 指數(shù)和 Chao1指數(shù)越大表示群落豐富度越高。采用 Excel 2007、SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性應(yīng)用 LSD 法開展多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2結(jié)果

2.1鐮刀菌根腐病發(fā)病狀況分析

雪茄煙田鐮刀菌根腐病的發(fā)病狀況見圖1。病情指數(shù)為0的土樣有10個，為未發(fā)病土壤；病情指數(shù)大于0的土樣有10個，平均病情指數(shù)為79.60，為發(fā)病土壤。

2.2土壤真菌群落 Alpha 多樣性分析

微生物 ITS 測序結(jié)果顯示（圖2），未發(fā)病和發(fā)病根際土壤的平均 Goods_coverage 達到0.9932和0.9955，表明測序深度基本覆蓋到未發(fā)病和發(fā)病土壤樣品中所有的真菌物種。從 Observed_species 稀釋曲線可以看出，隨著測序量的增加，真菌物種數(shù)量先急劇增加再趨于平緩，說明測序數(shù)量合理，可以反映土壤真菌絕大部分的序列信息。

由圖3可知，相對于未發(fā)病根際土壤，根腐病發(fā)病土壤真菌群落的 Observed_species 、Shannon、 Chao1和 Ace 指數(shù)分別降低了63.7%、28.6%、68.2%和61.3%，達極顯著水平（p<0.01）， Simpson 指數(shù)降低了5.6%，達顯著水平（p<0.05）。上述表明鐮刀菌根腐病的發(fā)生顯著降低了根際土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

2.3土壤優(yōu)勢真菌屬差異分析

對相對豐度前十的優(yōu)勢真菌屬進行群落差異分析。由表1可知，較未發(fā)病土壤，發(fā)病根際土壤的擬本森頓酵母菌（Pseudobensingtonia）相對豐度降低了88.9%，達極顯著水平（p<0.01），鐮刀菌（Fusarium）相對豐度增加了41.3%，達顯著水平（p<0.05）；毛霉菌（Mucor）、赤霉菌（Gibberella）、毛盤孢菌（Colletotrichum ）的相對豐度增加了157.9%、103.0%、1900.0%，孢霉菌（Mortierella）、錐蓋傘屬（Conocybe）的相對豐度降低了25.2%、91.7%，但差異均未達到顯著水平。相關(guān)性分析表明， Fusarium 與 Mortierella 、Gibberella 相對豐度分別呈極顯著負相關(guān)（r=–0.663，p<0.01）和顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.454，p<0.05）；根腐病病情指數(shù)與 Pseudobensingtonia 、Fusarium 相對豐度分別呈極顯著負相關(guān)（r=?0.586，p<0.01）和極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.610，p<0.01）。

2.4土壤理化性狀分析

由表2可知，根腐病發(fā)病土壤速效鉀、含水量、毛管孔隙度和通氣空隙度為329.0 mg/kg 、18.29%、29.93%、19.86%，較未發(fā)病土壤分別提高123.0 mg/kg、2.44%、5.46%和降低6.63%，均達顯著水平（p＜0.05），其他指標差異不顯著。相關(guān)性分析表明，雪茄煙根腐病病情指數(shù)與土壤含水量（r=0.603，p ＜0.01）和毛管孔隙度（r=0.729，p ＜0.01）極顯著正相關(guān)，與土壤速效鉀含量（r=0.508，p ＜0.05）顯著正相關(guān)，與土壤通氣孔隙度極顯著負相關(guān)（r=?0.591，p ＜0.01）。

2.5典型相關(guān)分析

選擇與病情指數(shù)相關(guān)性顯著（p＜0.05）的4個土壤理化指標（土壤含水量、毛管孔隙度、通氣孔隙度、速效鉀含量）及2個真菌指標（Fusarium 和 Pseudobensingtonia 相對豐度）開展典型相關(guān)分析（圖4），并結(jié)合 OTUs 矩陣構(gòu)建典型相關(guān)模型（p ＜0.05）。未發(fā)病與發(fā)病根際土壤真菌群落分離較好，兩個排序軸共解釋了45.80%的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。土壤含水量、毛管孔隙度、速效鉀含量和 Fusarium 相對豐度對發(fā)病土壤真菌群落有較大影響，有利于土壤根腐病發(fā)生的真菌群落構(gòu)建，導致病害的加?。煌寥劳饪紫抖群?Pseudobensingtonia 相對豐度對未發(fā)病土壤真菌群落有較大影響，其增加有利于土壤防控根腐病真菌群落的構(gòu)建，從而抑制病害發(fā)生。根據(jù)圖中箭頭長度可以看出，毛管孔隙度對真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，其次為通氣孔隙度。

3討論

微生物是評價土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要指標，能有效反映土壤質(zhì)量和生態(tài)功能的變化[15]。微生物的組成和數(shù)量對土壤的抑病性有顯著影響[16]，其群落多樣性與植物對抗病原菌的綜合能力正相關(guān)[17]。本文中雪茄煙鐮刀菌根腐病的發(fā)生降低了根際土壤真菌數(shù)量和群落多樣性，顯著增加了病原菌 Fusarium 的相對豐度，與鄭元仙等[18]在烤煙上的研究結(jié)論相似，表明雪茄煙鐮刀菌根腐病的發(fā)生與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、病原菌相對豐度增加、根際微群落轉(zhuǎn)化為病理組合等因素有直接關(guān)系[19]。

根際土壤中存在著大量的病原菌及病原菌拮抗微生物[20]。雪茄煙鐮刀菌根腐病的發(fā)生，顯著增加了Fusarium 相對豐度、降低了Pseudobensingtonia 相對豐度。Fusarium 是一種在土壤中繁殖較快的病原菌，其產(chǎn)生的毒素引起的植物根腐病，是作物減產(chǎn)、絕產(chǎn)的關(guān)鍵因素[21]，是煙草鐮刀菌根腐病發(fā)生的重要致病菌[22]。Pseudobensingtonia 屬于擔子菌門、傘型束梗孢菌綱的酵母菌類，未見其對植物致病的相關(guān)報道[23]。Mortierella 是雪茄煙田根際土壤中優(yōu)勢真菌屬（表1），本研究表明根際土壤中 Mortierella 與 Fusarium 極顯著負相關(guān)（r=?0.663，p ＜0.01），可能是 Mortierella 、Pseudobensingtonia等通過影響土壤真菌豐度和群落組成[24]以及采取生態(tài)位競爭等方式，間接抑制了致病菌 Fusarium 的繁殖，進而降低了雪茄煙根腐病的病情指數(shù)，具體的影響機制還有待進一步研究。Gibberella 屬于子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目叢赤殼科赤霉屬，目前相關(guān)研究并未發(fā)現(xiàn) Gibberella 對煙草有直接致病性[25]，但 Gibberella 會導致赤霉病危害水稻、小麥、大麥、玉米等禾谷類作物[26]。本研究中 Gibberella 與 Fusarium 呈顯著正相關(guān)（r=0.454，p ＜0.05），可能根際土壤中 Gibberella 與 Fusarium 具有協(xié)同效應(yīng)，間接導致雪茄煙鐮刀菌根腐病的加重。

理化性狀是土壤重要的非生物因素，能直接影響根腐病致病菌 Fusarium 的生長[27-28]。本文中雪茄煙根腐病病情指數(shù)與土壤通氣空隙度顯著負相關(guān)，說明提高通氣空隙度可能有利于雪茄煙鐮刀菌根腐病的防控。本研究通過相關(guān)性分析得出 Fusarium 相對豐度與土壤含水量（r=0.580，p ＜0.01）、毛管空隙度（r=0.586，p ＜0.01）極顯著正相關(guān)，說明土壤含水量和毛管孔隙度的增加，有利于 Fusarium 的繁殖，是導致雪茄煙鐮刀菌根腐病發(fā)病嚴重的重要因素之一[10]。土壤速效鉀含量對真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性有較大的影響[29]，左麗娟等[30]研究表明傳統(tǒng)施肥中，增施鉀肥能顯著提高煙草的根腐病抗性。但本文中速效鉀含量與雪茄煙鐮刀菌根腐病的病情指數(shù)顯著正相關(guān)，可能是取樣區(qū)域的雪茄煙田速效鉀含量較高，導致土壤鈣鎂等流失[31]，土壤團粒結(jié)構(gòu)下降，通透性變差、通氣空隙度降低，土壤含水量偏高，導致雪茄煙根系不發(fā)達，進而降低了對鐮刀菌根腐病的抵抗能力。

4結(jié)論

本研究表明，相對于未發(fā)病土壤，雪茄煙鐮刀菌根腐病的發(fā)生明顯降低了根際土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性，極顯著降低了 Pseudobensingtonia 相對豐度，顯著增加了Fusarium 相對豐度。 Fusarium 與 Mortierella 、Gibberella 相對豐度分別極顯著負相關(guān)和顯著正相關(guān)。根腐病病情指數(shù)與土壤含水量、毛管孔隙度、速效鉀含量和 Fusarium 相對豐度顯著正相關(guān)，與土壤通氣孔隙度和 Pseudobensingtonia 相對豐度顯著負相關(guān)。典型相關(guān)分析表明，土壤含水量、毛管孔隙度、速效鉀含量和 Fusarium 相對豐度對根腐病發(fā)病土壤的真菌群落有較大影響，土壤通氣孔隙度和 Pseudobensingtonia 相對豐度對未發(fā)病土壤真菌群落有較大影響。因此，來鳳縣雪茄煙區(qū)可綜合采取改良土壤物理結(jié)構(gòu)、平衡土壤養(yǎng)分、改善微生物群落組成等措施，降低土壤含水量、速效鉀和有害菌群（Fusarium 等）相對豐度，提高土壤通透性和 Pseudobensingtonia、Mortierella 相對豐度，達到防控雪茄煙鐮刀菌根腐病的目的。

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