食品中菌落總數(shù)和大腸菌群的測定分析

近年來，食品安全問題頻發(fā)，其中因微生物超標(biāo)所致的食品質(zhì)量問題占有較高的比重，因此加強(qiáng)食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)尤為重要。菌落總數(shù)、大腸菌群能夠反映食品被微生物污染的程度，前者是在特定條件下每克檢驗(yàn)樣品中形成的微生物菌落總數(shù)，后者屬于革蘭陰性無芽孢桿菌，在人類、動(dòng)物腸道中廣泛分布，可產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，兩者被公認(rèn)為醫(yī)藥、食品等安全性指示菌。目前，關(guān)于食品中菌落總數(shù)和大腸菌群的測定方法有很多，常用的如紙片法、國標(biāo)法等，不同方法的檢測流程不同，結(jié)果也可能存在一定的差異性。因此，采用科學(xué)、有效的方法檢測菌落總數(shù)和大腸菌群，可以為食品安全檢測提供重要依據(jù)，從而更好地督促食品企業(yè)進(jìn)一步保障食品安全。

一、材料與儀器

1.樣品來源。檢測樣品包括肉制品、蜜餞、面包蛋糕、醬油、包裝飲用水，均來源于XX食品有限公司；質(zhì)控樣均由北京中物信化化工技術(shù)研究院提供。

2.儀器與試劑。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；博迅BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CLJ-E301激光塵埃粒子計(jì)數(shù)器，蘇州市生源凈化設(shè)備有限公司；生物顯微鏡CX43LF，奧林巴斯貿(mào)易（上海）有限公司；電子天平JEA2002，上海浦春計(jì)量儀器有限公司；XK97-A菌落計(jì)數(shù)器，常州金壇友聯(lián)儀器研究院；LS-150LD立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；菌落測試紙片，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.國標(biāo)法。（1）大腸菌群測定。①樣品稀釋。對(duì)于固體、半固體食品，取樣25g保存于含有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，按照8000r/min的速率均質(zhì)處理2min左右，形成1：10的樣品勻液。對(duì)于液體食品，采用無菌吸管吸取25mL樣品，保存于含有225mL生理鹽水的無菌玻璃瓶中，采用機(jī)械振蕩器予以振搖處理，制作為1：10的樣品勻液。注意保證樣品菌液pH值為6.5-7.5，若pH未達(dá)到適宜范圍，可采用NaOH、HCL進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)。采用1mL移液器吸取樣品勻液（以1mL為宜），順管壁注入含有生理鹽水的無菌試管中，振搖試管，使樣品混合均勻，制備為1：100的樣品勻液。

②平板計(jì)數(shù)。選擇2-3個(gè)連續(xù)稀釋度并接種于無菌皿，每皿1mL，再在無菌皿中加入1mL生理鹽水作為空白對(duì)照。對(duì)15-20mL的VRBA進(jìn)行熔化、恒溫處理，溫度以46℃為宜，然后傾注于平皿，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)，使得培養(yǎng)基與樣液混合均勻。瓊脂凝固后，選擇3-4mL的VRBA將平板表層覆蓋，翻轉(zhuǎn)后，保存于36℃左右環(huán)境下，培養(yǎng)18-24h。

③平板菌落數(shù)的選擇。選擇菌落數(shù)范圍為15-150CFU的平板，對(duì)平板上可疑大腸菌群以及典型的菌落予以觀察。典型菌落從外觀上看為紫紅色，周圍可見膽鹽與酸所形成的沉淀環(huán)，直徑為0.5mm及以上。

④證實(shí)試驗(yàn)。在VRBA平板上選擇典型及可疑菌落，如果菌落數(shù)量＜10個(gè)，就需要挑出所有典型及可疑菌落，再在煌綠乳糖膽鹽肉湯管內(nèi)接種，溫度設(shè)置為36℃左右，培養(yǎng)24-48h，觀察產(chǎn)氣情況。如果產(chǎn)氣，則提示大腸菌群陽性。

（2）菌落總數(shù)測定。①培養(yǎng)。樣品稀釋操作同上，在培養(yǎng)階段等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，溫度調(diào)整為36℃左右，培養(yǎng)48h左右。水產(chǎn)品培養(yǎng)溫度調(diào)整為30℃左右，培養(yǎng)時(shí)間為72h左右。如果發(fā)現(xiàn)樣品中存在瓊脂培養(yǎng)基彌漫生長菌落，需等凝固后，將瓊脂培養(yǎng)基（4mL）覆蓋于瓊脂表面，經(jīng)過凝固處理再將平板翻轉(zhuǎn)，然后進(jìn)行培養(yǎng)。

②菌落計(jì)數(shù)。先肉眼觀察，或應(yīng)用菌落計(jì)數(shù)器對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行觀察記錄，并記錄對(duì)應(yīng)的菌落數(shù)量，菌落數(shù)范圍應(yīng)選擇30-300CFU。如果平板上無蔓延菌落，采用兩個(gè)平板的平均數(shù)表示各個(gè)稀釋度的菌落數(shù)。如果平板上菌落較大，一般不可采用，稀釋度的菌落數(shù)宜采取無片狀菌落的平板。如果片狀菌落低于平板的50%，另一半呈均勻分布，需要對(duì)半個(gè)平板計(jì)算后×2作為平板菌落數(shù)。菌落總數(shù)計(jì)算公式為N=，其中N表示樣品中菌落數(shù)，表示平板菌落數(shù)之和，n1、n2分別表示第1、第2稀釋度的平板個(gè)數(shù)，d表示稀釋因子。

2.紙片法。（1）菌落總數(shù)測定。樣品處理同上，在接種環(huán)節(jié)，針對(duì)每個(gè)樣品選擇2-3個(gè)稀釋度檢測，包裝飲用水可直接檢測原液。在無菌環(huán)境下，采用1mL滅菌吸管吸取1mL測試菌稀釋液，加入2個(gè)測試紙片，放下上蓋膜，放置5min凝固后，輕壓，放回自封袋，保持透明面向上，在36℃左右環(huán)境下培養(yǎng)15-24h。紙片上有紅色斑點(diǎn)提示細(xì)菌生長，在計(jì)數(shù)時(shí)需要×稀釋倍數(shù)，以獲得樣品的菌落總數(shù)。

（2）大腸菌群測定。采用無菌生理鹽水將大腸菌群檢測紙片浸潤，貼于被檢樣品，保存于無菌塑料袋，完成采樣后，將紙片保存于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h并觀察。紙片轉(zhuǎn)黃、可見紅色斑點(diǎn)表示陽性，紫藍(lán)色或未變黃則表示陰性。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。計(jì)數(shù)資料、計(jì)量資料表示方法分別為（%）（±s），前者用卡方檢驗(yàn)，后者用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)的組間比較均在SPSS22.0軟件上處理，根據(jù)P值范圍判斷有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05即差異顯著。

三、結(jié)果與分析

1.菌落總數(shù)檢測結(jié)果分析。兩種方法對(duì)不同樣品類型菌落總數(shù)的檢出結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

2.不同菌落數(shù)區(qū)間檢測結(jié)果分析。對(duì)不同樣品類型檢測結(jié)果中菌落數(shù)區(qū)間進(jìn)行分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

3.不同方法對(duì)大腸菌群的檢測結(jié)果分析。檢測結(jié)果顯示，國標(biāo)法對(duì)不同樣品大腸菌群的檢測結(jié)果差異不大，詳見表3。

四、結(jié)論與討論

作為食品質(zhì)量管理的重要組成部分，食品微生物檢驗(yàn)主要用于食品中菌落總數(shù)及大腸菌群、酵母菌等各類菌群繁殖情況的檢測，能夠?yàn)槭称钒踩a(chǎn)及衛(wèi)生評(píng)估提供可靠依據(jù)。菌落總數(shù)是微生物檢驗(yàn)的重要指標(biāo)，有助于了解食品受到污染的程度；大腸菌群則是一組與糞便污染相關(guān)的細(xì)菌，能夠判斷食品是否存在糞便污染。另外，菌落總數(shù)與大腸菌群存在本質(zhì)上的區(qū)別，前者涵蓋了有益菌與致病菌，菌落總數(shù)超標(biāo)提示致病菌超標(biāo)可能性更大，但不能直接得出致病菌超標(biāo)的結(jié)論。

本研究將國標(biāo)法與紙片法對(duì)照，檢測結(jié)果差異不明顯，表明兩種方法均具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可應(yīng)用于食品微生物檢驗(yàn)。紙片法操作步驟簡單，無需培養(yǎng)基配置，無需高壓滅菌，能夠減少人力、物力的投入，但對(duì)較大菌量的計(jì)數(shù)存在困難，且目前僅研制出少數(shù)幾種類型的測試片，存在一定的局限性。應(yīng)用國標(biāo)法進(jìn)行食品菌落總數(shù)、大腸菌群測定，準(zhǔn)確性高，能夠較好地檢出污染嚴(yán)重的樣品。國標(biāo)法用時(shí)長、操作相對(duì)復(fù)雜，其他方法雖然能夠簡化步驟、縮短流程，但所需成本較高，僅能滿足特定食品檢驗(yàn)需求，因此，國標(biāo)法仍是目前應(yīng)用最為廣泛的方法，應(yīng)加強(qiáng)新技術(shù)研發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)方法，以保障檢測的精準(zhǔn)性、經(jīng)濟(jì)性。

需要注意的是，在各個(gè)檢驗(yàn)環(huán)節(jié)應(yīng)做好質(zhì)量把控，堅(jiān)持無菌操作的原則，精準(zhǔn)執(zhí)行每個(gè)步驟，以保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。每次檢驗(yàn)時(shí)打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板，在環(huán)境中的暴露時(shí)間應(yīng)在15min以上，同時(shí)對(duì)平板及本批次樣品進(jìn)行培養(yǎng)。

作者簡介：張慧（1988-），女，甘肅慶陽人，助理工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称窓z測。