水蛭真?zhèn)舞b定和質(zhì)量評價方法研究進展

吉舒琪,張慧婷,王夢軒,宮玉潔,王藝穎,劉玉姣,董紅敬,張波

(1.臨沂大學藥學院,山東 臨沂 276000;2.齊魯工業(yè)大學<山東省科學院>,山東省分析測試中心,山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點實驗室,山東 濟南 250014)

水蛭為水蛭科動物螞蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(HirudonipponicaWhitman)或柳葉螞蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥全體,具有破血通經(jīng),逐瘀消癥功能,主治血瘀經(jīng)閉,癥瘕痞塊、中風偏癱以及跌打損傷等疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)水蛭相關(guān)制劑在防治心腦血管疾病和抗癌方面具有特效,多用于急性結(jié)膜角膜瘢翳等臨床癥狀,且以水蛭為原料的中成藥如通心絡(luò)膠囊、腦血康滴丸、腦心通膠囊等更是被納入2019年的《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》[2]?？梢?水蛭功效顯著,應(yīng)用廣泛。

水蛭屬于動物類中藥,其野生資源匱乏且養(yǎng)殖技術(shù)要求高,加上水蛭藥材市場需求量增大,導(dǎo)致價格偏高且供不應(yīng)求。因此,市場上出現(xiàn)多種水蛭混偽品,致使水蛭質(zhì)量參差不齊,嚴重影響臨床用藥的安全性與有效性。故加強水蛭的真?zhèn)舞b別與質(zhì)量評價方法的研究與利用具有十分重要的意義。

鑒于上述情況,本研究以中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、PubMed、Science Direct、Web of Science等數(shù)據(jù)庫中查詢的2000年1月—2022年8月發(fā)表的相關(guān)文獻為參考資料,對水蛭的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價方法進行了綜述,旨在為臨床使用更安全有效的水蛭藥材提供更多保障,亦為水蛭藥材的質(zhì)量控制方法研究提供參考。

1 真?zhèn)舞b別

正品醫(yī)用水蛭來源為《中國藥典》收載的螞蝗(寬體金線蛭)、水蛭(日本醫(yī)蛭)和柳葉螞蝗(尖細金線蛭)[1]。但由于主觀摻入或無意混用,市場上出現(xiàn)了多種水蛭藥材的混偽品,如偽品菲牛蛭(Hirudinariamanillensis)、天目山蛭(Haemadipsalimuna)以及Erpobdellabscura等?，F(xiàn)有研究多通過性狀鑒別、理化鑒別和分子鑒別等技術(shù)手段進行真?zhèn)舞b別。

1.1 性狀鑒別 不同于植物類藥材的主要性狀特征,水蛭及其偽品的性狀鑒別點主要在于生殖孔、尾部吸盤、背部紋理、前端吸盤開口部位、顎齒等多個方面的差異[3](詳見表1)。水蛭的性狀鑒別主要靠其專屬性的性狀特征,大多是利用感官去鑒別,主觀因素影響大,且水蛭的性狀會受到外界環(huán)境變化的影響,不同地區(qū)的水蛭在大小,性狀上也存在著一些差別,鑒別準確度較低[4]。

表1 水蛭及其偽品性狀鑒別特征匯總

1.2 理化鑒別 薄層色譜是較為常用的理化鑒別方法,《中國藥典》2020年版采用的水蛭薄層色譜鑒別方法條件為：以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑,硅膠G薄層板為固相載體,通過噴加10%硫酸乙醇溶液并置105 ℃烤板后進行斑點顯色,與標準藥材對照鑒別[1]。

1.3 分子鑒別 分子鑒別方法是現(xiàn)代中藥鑒別中的研究熱點,具有結(jié)果客觀、準確、取樣少、不受檢測樣品性狀影響等優(yōu)點,在動物類藥材的真?zhèn)舞b別中應(yīng)用較為廣泛[7]。COI基因片段是水蛭DNA條形碼的有效候選基因之一,王文秀等[8]通過比對寬體金線蛭與其常見混偽品的COI序列,尋找寬體金線蛭COI基因序列內(nèi)SNP位點,設(shè)計特異性引物后進行PCR擴展,依據(jù)是否有明顯擴增條帶或核酸染料是否有熒光進行真?zhèn)舞b別。劉杰等[9]通過PCR和微芯片電泳檢測的方法可以同步鑒別3個品種水蛭的人為預(yù)混樣品,且不存在引物之間相互結(jié)合或非特異性擴增的現(xiàn)象,鑒別結(jié)果準確。

除水蛭生藥和粉末采用上述方法外,含水蛭的中成藥的鑒別也多采用此法,朱曉梟等[10]基于COI基因序列,分別設(shè)計了針對寬體金線蛭和日本醫(yī)蛭的特異性引物,用于特異性鑒別腦心通膠囊中水蛭的有效成分及質(zhì)量監(jiān)測。另外,劉曉帆等[11]基于COI序列,通過鄰接法所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖發(fā)現(xiàn)同屬序列聚在一起,水蛭的正品來源寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭形成一個獨立的支,支持率近100%,其他偽品聚集為獨立的一支,說明水蛭的正品來源與其偽品能夠明顯區(qū)分開。

1.4 蛋白質(zhì)電泳法鑒別 蛋白質(zhì)電泳鑒別技術(shù)是依據(jù)中藥中所含蛋白質(zhì)分子的大小、形狀或所帶電荷差異,采用電泳分離來鑒別中藥的方法[12]。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是膠體電泳的一種,其將蛋白質(zhì)溶液與SDS混合,SDS為界面活性劑,會破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)使其變性并包覆變性蛋白質(zhì),使其帶有一致的負電荷和一致的形狀,故蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量,而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)[13]。

水蛭主要成分為大分子化合物如蛋白質(zhì),其次還含有氨基酸、喋啶類、類以及脂肪酸類成分等[14]。不同品種或不同生長環(huán)境的水蛭其蛋白質(zhì)組成及含量上有所差異,基于此,汪波等[15]采用SDS-PAGE對我國7種常見水蛭的組織細胞可溶性蛋白成分進行電泳圖譜特性分析,結(jié)果表明SDS-PAGE能初步反映不同種類、不同食性水蛭組織細胞可溶性蛋白質(zhì)的表達差異,可用于不同品種水蛭的鑒別。

1.5 毛細管電泳法 劉興國等[16]采用高效毛細管電泳法對寬體金線蛭和混淆品菲牛蛭進行蛋白、多肽的分析,發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭與菲牛蛭的高效毛細管電泳圖譜之間有明顯差異,且重復(fù)性良好。

2 質(zhì)量評價

目前,對于水蛭的質(zhì)量評價除常規(guī)的水分、總灰分、酸不溶性灰分檢測以外,還包括其特異性的質(zhì)量評價手段,如抗凝血酶活性測定以及針對水蛭中蛋白質(zhì)類、核苷類、多胺類、揮發(fā)性成分等不同化學成分的定性定量評價。

2.1 生物檢定技術(shù) 水蛭中含有多種抗凝劑,據(jù)研究報道水蛭素已經(jīng)廣泛用于腦血栓、冠心病、腦水腫[17]、糖尿病[18]等的治療,已發(fā)現(xiàn)且可直接作用于凝血系統(tǒng)的成分主要有水蛭素、吻蛭素、類肝素、組胺等[14]。因此,抗凝血活性是水蛭的主要活性,也是《中國藥典》[1]中評價水蛭質(zhì)量的主要方法,其檢測方法為生物活性測定法,該方法用于中藥質(zhì)量控制,可以反映中藥的整體或者主要的藥理作用,與單純控制指標性成分有較大的進步。

除藥典方法外,多位學者還創(chuàng)新了一些新的水蛭抗凝血酶評價方法,如蘇斌等[19]建立了一種基于用血液凝固分析儀測定纖維蛋白原-凝血酶時間的水蛭生物活性測定方法(Fibg-TT法),其就基源為螞蟥和日本醫(yī)蛭分別建立了反應(yīng)體系,用生物檢定統(tǒng)計法測定供試品的效價,結(jié)果表明螞蟥和日本醫(yī)蛭標準品的效價分別為5 650 U·g-1和4 130 U·g-1,當兩者浸提液的一定濃度范圍時,對數(shù)凝固時間與濃度線性較好,準確度和中間精密度均良好,證明Fibg-TT法能區(qū)分和量化不同批次水蛭的效價。金家金等[20]將不同濃度的水蛭浸提液加入富血小板血漿和乏血小板血漿中,結(jié)果顯示水蛭能增加血小板聚集率,對凝血酶原時間未見顯著性的影響,能顯著延長活化部分凝血酶時間和纖維蛋白原-凝血酶時間,在一定的濃度范圍內(nèi),水蛭浸提液濃度與纖維蛋白原-凝血酶時間的對數(shù)凝固時間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,證明了Fibg-TT和活化部分凝血酶時間(APTT)反應(yīng)體系可以用于水蛭體外生物活性測定。肖凌等[21]將生物檢定技術(shù)應(yīng)用于水蛭抗凝血活性的測定,探討反映水蛭生物活性的質(zhì)量控制方法,結(jié)果表明4種水蛭活性部分凝血酶時間法的量效關(guān)系曲線與肝素的量效關(guān)系曲線類似,突躍范圍呈平行關(guān)系,上述特點符合生物檢定的要求,以肝素鈉作為標準品,采用生物檢定技術(shù)活性部分APTT測定水蛭等的抗凝活性是可行的,證明了活化部分APTT可以全面反映水蛭的抗凝血作用,測定結(jié)果對臨床使用更具指導(dǎo)意義。

2.2 SDS-PAGE法 水蛭不僅存在品種的差異,不同的炮制方法對其藥物質(zhì)量也有一定的影響。國家和地方炮制規(guī)范對水蛭燙制工藝的溫度、時間、滑石粉用量、翻炒速度等關(guān)鍵參數(shù)均無統(tǒng)一規(guī)定,大多憑主觀經(jīng)驗評價,從而影響了炮制品質(zhì)量?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)炮制方法不同,水蛭炮制前后的水溶性蛋白存在一定差異。

馬莉等[22]采用雙向電泳分析水蛭酒炙前后差異蛋白表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接裂解液法所得條帶數(shù)量最多,分布連貫清晰;水蛭酒炙前后蛋白含有量有顯著性差異,所以雙向電泳所得差異蛋白可作為蛋白標志物,以規(guī)范水蛭炮制工藝,并確保其穩(wěn)定性。

2.3 HPLC法 高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法,注入的供試品由流動相帶入柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分離,并依次進入檢測器,由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號,具有靈敏度高、重復(fù)性好、易于標準化等優(yōu)點。多位學者嘗試建立了用于水蛭化學成分分析的HPLC方法[23-25](見表2),以期更好地對水蛭進行質(zhì)量評價。

表2 HPLC 檢測水蛭中的化學成分

此外,HPLC還可以與質(zhì)譜聯(lián)檢測器用(HPLC-MS),HPLC-MS可綜合HPLC與MS的優(yōu)勢于一體,實現(xiàn)對目標樣品的多成分準確鑒別。如朱曉梟等[26]利用HPLC-MS技術(shù)研究腦心通膠囊中的蛋白質(zhì),其基于超高分辨質(zhì)譜技術(shù)及蛋白質(zhì)組學的方法用于腦心通膠囊中3種動物藥的蛋白質(zhì)分析,此研究彌補了腦心通膠囊中蛋白類成分研究的空白,實現(xiàn)了對于腦心通膠囊中多種成分的準確鑒別。

2.4 IR法 IR技術(shù)具有快速、無損、無污染以及可視化等優(yōu)點,可有效反應(yīng)藥材組織上的官能團信息。李彥希等[27]基于紅外光譜法結(jié)合化學計量學進一步對光譜數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果水蛭與美洲大蠊、全蝎的紅外指紋圖譜有差異,3種蟲類藥材在1 800～1 700 cm-1處峰形差異明顯較大,二階導(dǎo)數(shù)產(chǎn)地特征峰差異明顯,說明IR技術(shù)可用于鑒別水蛭及其混淆品,可作為水蛭質(zhì)量評價方法之一。

2.5 GC-MS法 揮發(fā)性成分與抗凝血酶活性是水蛭的質(zhì)量鑒別指標之一,揮發(fā)性成分的差異與種質(zhì)及其生長環(huán)境密切相關(guān),因此通過比較水蛭揮發(fā)性成分與抗凝血活性成分組成及含量差異可以從一定程度上反應(yīng)藥材的質(zhì)量差異。黃榮清等[17]應(yīng)用GC-MS技術(shù)分析鑒別了水蛭提取物中有很強的抗凝血活性的15個化合物,主要為不飽和脂肪酸甲酯以及甾體等。而劉君等[28]采用GC-MS法分析了中藥螞蟥脂肪酸的組成,鑒別了19個組分,其中不飽和脂肪酸占71.84%,飽和脂肪酸占20.71%,為水蛭鑒別提供了數(shù)據(jù)支撐。隋利強等[29]通過SPME-GC-MS分析探討了炮制對水蛭揮發(fā)性成分的影響,結(jié)果從水蛭的揮發(fā)性成分中鑒別出40種化合物。水蛭炮制前后揮發(fā)性成分含量差異明顯,炮制過程中棕櫚酸的含量降低。

2.6 指紋圖譜技術(shù) 指紋圖譜技術(shù)可從整體上反應(yīng)藥材質(zhì)量,避免了以單個或少數(shù)幾個指標性成分為依據(jù)的中藥質(zhì)量評價略顯片面的問題,在中藥質(zhì)量評價領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。目前所建立的水蛭的指紋圖譜主要分為HPLC指紋圖譜和SDS-PAGE指紋圖譜兩類。產(chǎn)地、品種的差異均會導(dǎo)致水蛭基因表達的差異,進而導(dǎo)致化學成分的差異,最終形成不同的藥材質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)即是以多批次藥材的成分分析結(jié)果來評價藥材質(zhì)量的一致性或穩(wěn)定性,而HPLC指紋圖譜和SDS-PAGE指紋圖譜的區(qū)別主要在于,HPLC指紋圖譜是以小分子化合物為研究對象,SDS-PAGE指紋圖譜則是以蛋白質(zhì)大分子為研究對象?，F(xiàn)有水蛭指紋圖譜信息見表3[30-34]。

表3 水蛭指紋圖譜信息

2.7 灰度關(guān)聯(lián)質(zhì)量評價模式 李峰等[35]在對不同品種、不同規(guī)格的水蛭中多個成分(核苷類、多胺類、總多糖、總磷脂、蛋白質(zhì))和抗凝血酶活性測定的基礎(chǔ)上,通過定義的相對關(guān)聯(lián)度為測度,建立了灰關(guān)聯(lián)度模型,用以評價水蛭質(zhì)量,該評價模式全面客觀。

3 討論與總結(jié)

3.1 水蛭真?zhèn)舞b別方法研究現(xiàn)狀 目前,水蛭的真?zhèn)舞b別方法主要性狀鑒別、理化鑒別、分子鑒別、SDS-PAGE鑒別、毛細管電泳法鑒別等多種方法。性狀鑒別中,不同品種水蛭在大小及各部位組織特征上有一定差異,可實現(xiàn)結(jié)構(gòu)未被破壞生藥的鑒別,但對于含水蛭的中成藥中水蛭原料真?zhèn)螣o法鑒別;理化鑒別則以對照藥材為依據(jù)進行鑒別,方法簡便高效;分子鑒別主要以COI基因片段為研究對象,通過位點特異性PCR或分子進化樹等實現(xiàn)水蛭的鑒別,同時可用于水蛭粉末及其中成藥的鑒別,方法準確性最高;由于水蛭為動物藥材,蛋白質(zhì)信息豐富,因此SDS-PAGE鑒別法和毛細管電泳法鑒別也較為常用,且適用于不同品種,不同產(chǎn)地水蛭的鑒定。

3.2 水蛭質(zhì)量評價方法研究現(xiàn)狀 水蛭的質(zhì)量評價方法主要以生物檢定技術(shù)、SDS-PAGE、HPLC、GC-MS、IR、指紋圖譜技術(shù)等為主。水蛭抗凝血活性顯著,也是其臨床應(yīng)用的主要活性之一,因此采用生物檢定技術(shù)對其抗凝血活性進行檢測是評價水蛭的主要方式之一。SDS-PAGE主要以水蛭中的蛋白質(zhì)為評價對象,但該方法受到提取條件的影響較大,且多以定性評價為主,無法定量;HPLC多以水蛭中的胺類、核苷類和喋啶類成分為評價對象,而GC-MS則以水蛭中的脂肪酸、甾體為主要評價對象,對于目前尚未明確水蛭藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的情況下,指標性成分的選擇對質(zhì)量評價的實際意義具有局限性;IR和指紋圖譜技術(shù)則是從整體上評價水蛭質(zhì)量的常用方法,目前指紋圖譜仍以HPLC和SDS-PAGE檢測技術(shù)為主。此外,灰關(guān)聯(lián)度模式在動物類藥材質(zhì)量評價中也有較廣泛應(yīng)用,且具有指標豐富,評價客觀等優(yōu)點?？梢?目前對于水蛭的質(zhì)量評價方法研究雖然較為廣泛,但方法的適用性和實際價值還有待深入研究,目前以抗凝血酶活性評價的生物檢定法和整體評價的指紋圖譜技術(shù)具有較高實用價值。

4 展望

水蛭為臨床常用動物藥材之一,目前已經(jīng)明確水蛭素是其主要抗凝血成分,但水蛭臨床應(yīng)用炮制品常需要滑石粉燙制,高溫處理易導(dǎo)致水蛭素失活,可見水蛭活性成分并非僅包含以水蛭素為代表的蛋白質(zhì)類成分,還包含其他活性成分。再者,水蛭除活血化瘀外的多種藥效如抗腫瘤[36-37]、抗纖維化[38]、抗糖尿病腎病[39-40]等亦可佐證。因此,對于水蛭的質(zhì)量評價方法應(yīng)充分考慮水蛭的多活性、多物質(zhì)基礎(chǔ)的特點,開發(fā)更加綜合全面的質(zhì)量評價方法?；蛘呱钊胙芯克幮镔|(zhì)基礎(chǔ),從而建立針對物質(zhì)基礎(chǔ)的定性定量評價方法。而對于真?zhèn)舞b別方法而言,通過性狀鑒別結(jié)合分子鑒別的手段基本可滿足水蛭中藥材和中成藥的鑒定,但仍應(yīng)向簡便化、現(xiàn)場化應(yīng)用的實際應(yīng)用方向繼續(xù)開發(fā)。