全自動(dòng)樣品前處理技術(shù)在中藥禁用農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用

翁艷鴻,李艷萍,巫鑫城,許文,李平,林志杰,徐偉,褚克丹

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;3.?？萍瘓F(tuán)股份有限公司,福建 廈門 361006)

在新冠肺炎疫情防控中,中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用,大幅度提高了新冠肺炎患者的治愈率[1]。中藥治療效果逐漸被更多人認(rèn)可,中藥材的需求量隨之增大。為了提高中藥材產(chǎn)量,藥農(nóng)常超標(biāo)使用農(nóng)藥,而農(nóng)藥對(duì)人的健康會(huì)產(chǎn)生較大的危害[2-7],同時(shí)也影響中藥材及其產(chǎn)品在國際市場的競爭力[8]。因此,開展中藥農(nóng)藥殘留檢測工作具有重大意義。

農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)在不斷發(fā)展,QuEChERS方法于2003年正式公布用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留分析[9]。由于該方法具有快速、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的主流方法。QuEChERS方法隨之發(fā)展出不同的版本,其中公認(rèn)兩種官方法—AOAC 2007方法[10]和EN15662方法[11], GB23200.113-2018[12]中和《中國藥典》2020年版[13]第五法“2341農(nóng)藥殘留量測定法”中均采用了QuEChERS方法。近年來,研究者根據(jù)目標(biāo)化合物的特性對(duì)QuEChERS方法進(jìn)行了改良升級(jí),多限于提取凈化步驟[14-17],未對(duì)操作方法進(jìn)行升級(jí)。QuEChERS方法需振蕩來完成提取和凈化,但由于操作人員的不同導(dǎo)致手動(dòng)振蕩無法達(dá)到均一的效果,往往影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程的轉(zhuǎn)移增加了操作人員接觸有毒有害試劑的風(fēng)險(xiǎn)。中藥種類繁多、前處理方法復(fù)雜,大大增加實(shí)驗(yàn)人員的檢測工作,因此,亟待一種更為簡單、安全、有效的方法來替代手動(dòng)操作解決樣品前處理中的問題。

全自動(dòng)QuEChERS樣品前處理包括樣品管理模塊、自動(dòng)開關(guān)蓋模塊、自動(dòng)液體處理平臺(tái)、自動(dòng)加鹽模塊、垂直振蕩模塊、離心機(jī)模塊、水浴模塊、渦旋本模塊,采用六軸機(jī)械手將所有模塊進(jìn)行整合,使樣品可在各個(gè)模塊之間進(jìn)行流轉(zhuǎn),全流程實(shí)現(xiàn)QuEChERS方法的自動(dòng)化,滿足樣品前處理快速、高通量、自動(dòng)化、在線聯(lián)機(jī)的需求。為了進(jìn)一步促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展,本試驗(yàn)分別從根莖類、花類、果實(shí)類藥材中選擇一種代表性藥材,即人參、金銀花、枸杞,且三者均為藥食同源和大品種藥材,通過3種不同種類的基質(zhì)進(jìn)行手動(dòng)和自動(dòng)QuEChERS法測定農(nóng)藥殘留對(duì)比,以探索全自動(dòng)樣品前處理在中藥禁用農(nóng)藥檢測中的適用性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 多功能粉碎機(jī)(BJ-400T);7890A-7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);Auto EVA 20plus全自動(dòng)平行氮吹儀(?？萍瘓F(tuán)有限公司);i-Pure PRO2超純水儀;TD5A-WSX型離心機(jī)(湖南湘儀);CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)。

ISP600全自動(dòng)樣品前處理工作站(?？萍瘓F(tuán)有限公司)：由雙高精度注射泵和電容針實(shí)現(xiàn)目標(biāo)液體定量吸取,代替手工移液;振蕩模塊通過杠桿原理放大振幅,運(yùn)用鐘擺式垂直振蕩,模擬人工手臂振蕩的弧線軌跡,來實(shí)現(xiàn)更好的振蕩混勻效果;加鹽模塊在電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)和氣缸配合下完成自動(dòng)加鹽的過程,實(shí)現(xiàn)了樣品對(duì)目標(biāo)成分的提取和凈化,ISP600運(yùn)行自動(dòng)化QuEChERS方法的具體流程見圖1。

色譜純乙腈(德國Merck公司),其余試劑均為分析純。AOAC提取鹽管(編號(hào)：RC-50071K2,6 g無水硫酸鎂,1.5 g醋酸鈉,氧化鋯);凈化鹽(編號(hào)：RC-15030,無水硫酸鎂900 mg,N-丙基乙二胺 300 mg,十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg,硅膠300 mg,石墨化碳黑90 mg);無水硫酸鎂、醋酸鈉、氧化鋯、無水硫酸、N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠、石墨化碳均來自?？萍瘓F(tuán)有限公司;35種混合農(nóng)藥對(duì)照品(CDAA-M-490419-TZ-1.2 mL)和內(nèi)標(biāo)磷酸三苯酯(CDAA-S-412134-JD-1 mL,1 000 mg·L-1)均購置于Anpel。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：DB-17色譜柱(0.25 mm×30 m,25 μm),進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣,載氣為高純氦氣(He),進(jìn)樣口為恒壓模式,柱前壓力為146 kPa,程序升溫：初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃·min-1升至120 ℃,再以10 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃,再以2 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃,最后以15 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃,保持6 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊源(EI),離子源溫度250 ℃,質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃,質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),溶劑延遲5 min,各化合物參考保留時(shí)間、監(jiān)測離子對(duì)、碰撞電壓(CE)見表1,總離子圖見圖2。為提髙檢測靈敏度,根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測各農(nóng)藥。

表1 35種禁用農(nóng)藥的保留時(shí)間和多反應(yīng)檢測條件

編號(hào)1～36農(nóng)藥具體見表1圖2 混合對(duì)照品總離子色譜圖

1.3 對(duì)照品溶液的制備 混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取禁用農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液(已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度)500 μL,置25 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,即得一級(jí)混合對(duì)照品溶液。精密吸取一級(jí)混合對(duì)照品溶液1 mL,用乙腈定容于2 mL,得二級(jí)混合對(duì)照品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密量取磷酸三苯酯對(duì)照品150 μL,置25 mL量瓶中,加乙腈制成0.6 mg·mL-1溶液。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 手動(dòng)制備樣品 根據(jù)《中國藥典》2020年版(四部)“2341農(nóng)藥殘留測定法”中的第五法,取樣品打成粉末(過三號(hào)篩)后,精密稱定3 g,置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中,加入1%冰醋酸溶液15 mL,渦旋使藥粉充分浸潤,放置30 min,精密加入乙腈15 mL,渦旋使混勻,劇烈振蕩5 min,加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末(4∶1)7.5 g,立即搖散,再劇烈振蕩3 min,于冰浴中冷卻10 min,離心(4 000 r·min-1)5 min,取上清液9 mL,置預(yù)先裝有無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺 300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg的15 mL離心管中,渦旋使充分混勻,劇烈振蕩5 min使凈化完全,離心(4 000 r·min-1)5 min,精密吸取上清液5 mL,置氮吹儀上于40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL,加乙腈稀釋至1.0 mL,渦旋混勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.4.2 自動(dòng)化儀器制備 樣品打成粉末(過三號(hào)篩)后,精密稱定3 g,置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中,放入全自動(dòng)樣品前處理工作站,并根據(jù)手動(dòng)方法設(shè)定實(shí)驗(yàn)具體參數(shù)并放入提取鹽管和凈化管,進(jìn)行制備。制備結(jié)束后,樣品置自動(dòng)平行氮吹儀上于40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL,加乙腈稀釋至1.0 mL,渦旋混勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 自動(dòng)樣品與手動(dòng)方法回收率比較 分別采用手動(dòng)與自動(dòng)QuEChERS方法制備人參、金銀花、枸杞樣品,通過10 μg·kg-1添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收率比較,結(jié)果使用SPSS軟件進(jìn)行回收率差異性分析,將35種農(nóng)藥根據(jù)種類不同進(jìn)行分析討論。圖3～9中*為手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有顯著性差異(P<0.05),**為手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01)。

圖3 2種QuEChERS方法對(duì)人參中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率

2.1.1 有機(jī)磷農(nóng)藥 人參基質(zhì)樣品的手動(dòng)與自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,14種有機(jī)磷農(nóng)藥中甲基對(duì)硫磷、甲基異柳磷和蠅毒磷的手動(dòng)與自動(dòng)回收率無顯著性差異,其余11種有機(jī)磷農(nóng)藥有顯著性差異(P<0.05),其中O-內(nèi)吸磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、久效磷、對(duì)硫磷、水胺硫磷、甲基硫環(huán)磷具有極顯著性差異(P<0.01)。在有顯著性差異的11種農(nóng)藥中,僅有久效磷的手動(dòng)回收率優(yōu)于自動(dòng),剩余10種農(nóng)藥均為自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng),結(jié)果見圖3。

金銀花基質(zhì)樣品的手動(dòng)和自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,14種有機(jī)磷農(nóng)藥中,治螟磷、甲拌磷、久效磷和蠅毒磷具有顯著性差異(P<0.01),其余10種農(nóng)藥均無顯著性差異,在4種有差異的農(nóng)藥中久效磷回收率手動(dòng)優(yōu)于自動(dòng),而治螟磷、甲拌磷和蠅毒磷的回收率均自動(dòng)優(yōu)于手動(dòng),結(jié)果見圖4。

圖4 2種QuEChERS方法對(duì)金銀花中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率

枸杞基質(zhì)樣品手動(dòng)與自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,水胺硫磷的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有顯著性差異(P<0.05),O-內(nèi)吸磷的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01),兩者回收率均為自動(dòng)優(yōu)于手動(dòng),其余12種農(nóng)藥均無顯著性差異,結(jié)果見圖5。

圖5 2種QuEChERS方法對(duì)枸杞中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率

2.1.2 有機(jī)氯農(nóng)藥 人參基質(zhì)樣品的手動(dòng)與自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,15種有機(jī)氯農(nóng)藥,除β-六六六手動(dòng)和自動(dòng)回收率無顯著性差異外,其余14種農(nóng)藥均具有顯著性差異(P<0.05),其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、艾氏劑、2,4′-三氯殺螨醇、4,4′-三氯殺螨醇、α-硫丹、狄氏劑、4,4′-滴滴伊、4,4′-滴滴滴和硫丹硫酸酯的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01)。在具有差異性農(nóng)藥中,除了α-硫丹的手動(dòng)回收率優(yōu)于自動(dòng),其余13種農(nóng)藥均為自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng),結(jié)果見圖6。

圖6 2種QuEChERS方法對(duì)人參中有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率

金銀花基質(zhì)樣品的手動(dòng)與自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,β-六六六和2,4′-滴滴涕的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有顯著性差異(P<0.05),艾氏劑、2,4′-三氯殺螨醇、α-硫丹、狄氏劑、4,4′-滴滴伊、2,4′-滴滴涕和4,4′-滴滴涕的手動(dòng)與自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01),且8個(gè)差異性農(nóng)藥自動(dòng)回收率均優(yōu)于手動(dòng),結(jié)果見圖7。

圖7 2種QuEChERS方法對(duì)金銀花中有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率

枸杞基質(zhì)樣品基質(zhì)樣品的手動(dòng)與自動(dòng)回收率結(jié)果顯示,15種有機(jī)氯農(nóng)藥手動(dòng)和自動(dòng)回收率兩者均在80%～100%之間,但兩者之間的15種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率均無顯著性差異,結(jié)果見圖8。

圖8 2種QuEChERS方法對(duì)枸杞中有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率

2.1.3 其他類農(nóng)藥 人參基質(zhì)樣品中除草醚的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有顯著性差異(P<0.05),殺蟲脒、氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈、氟蟲腈砜的手動(dòng)與自動(dòng)回收率均具有極顯著性差異(P<0.01),且6種農(nóng)藥的自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng)。金銀花基質(zhì)樣品中氟蟲腈砜的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01)且自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng)回收率,其余5種農(nóng)藥無顯著性差異。枸杞基質(zhì)樣品中,氟甲腈、氟蟲腈和除草醚的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有極顯著性差異(P<0.01),氟甲腈手動(dòng)回收率優(yōu)于自動(dòng),氟蟲腈和除草醚自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng),其余3種農(nóng)藥無顯著性差異。殺蟲脒在3種基質(zhì)中回收率都低于60%,不符合分析要求的回收率范圍,其原因除了在前處理過程產(chǎn)生的操作損失外,可能是由于凈化填料對(duì)殺蟲脒產(chǎn)生吸附,導(dǎo)致其回收率偏低,結(jié)果見圖9。

圖9 2種QuEChERS方法對(duì)人參(a)、金銀花(b)、枸杞(c)中其他農(nóng)藥的回收率

2.2 方法的線性和檢測限 本試驗(yàn)方法線性范圍參照《中國藥典》2341第五法,精密稱取3 g空白基質(zhì)樣品各6份,經(jīng)過全自動(dòng)方法制備樣品,置全自動(dòng)平行氮吹儀上,40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL,分別加入二級(jí)混合對(duì)照品溶液5、10、25、50、75、100、150 μL,加乙腈稀釋定容至1 mL,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL,渦旋混勻,濾過,取續(xù)濾液。分別精密吸取上述溶液各1 μL進(jìn)樣,得各目標(biāo)農(nóng)藥相應(yīng)的峰面積,以各個(gè)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),以各個(gè)農(nóng)藥的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y),經(jīng)線性回歸,得到各個(gè)目標(biāo)農(nóng)藥的回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)(r),采用空白樣品添加方式考察農(nóng)藥的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),結(jié)果見表2。結(jié)果顯示人參基質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.996 1～0.999 9之間,金銀花基質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.995 4～0.999 9之間 ,枸杞基質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.995 9～0.999 9之間,3種基質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均>0.990,說明線性關(guān)系良好,滿足分析要求。3種基質(zhì)的自動(dòng)QuEChERs方法的定量限都小于藥典規(guī)定的限量值,符合中藥農(nóng)藥殘留檢查的要求。

表2 人參、金銀花、枸杞樣品35種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限(μg·kg-1)

2.3 加樣回收試驗(yàn) 農(nóng)藥殘留物檢測多采用加樣回收率方式來判斷,本試驗(yàn)以《中國藥典》2020年版0212藥材和飲片檢定通則中33種禁用農(nóng)藥的最大殘留限量(MRL)為依據(jù),采用1/5 MRL、MRL、2 MRL 3種濃度水平進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)(n=6),在滿足重復(fù)性要求(1 mg·kg-1以下,RSD≤15%)[18],回收率應(yīng)在70%～120%之間[13]。

精密稱取人參、金銀花、枸杞空白樣品基質(zhì)粉末3 g,分別添加15、75、150 μL一級(jí)混合對(duì)照品,每個(gè)加標(biāo)濃度平行6次,采用全自動(dòng)前處理平臺(tái)制備樣品,分別精密吸取上述的基質(zhì)樣品各1 mL,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL,混勻后進(jìn)樣。分別計(jì)算3種基質(zhì)自動(dòng)的回收率和RSD,結(jié)果見表3。除殺蟲脒外,其余34種農(nóng)藥在人參中回收率為71.45%～96.15%,RSD為0.3%～7.5%,金銀花中回收率為70.05%～111.41%,RSD為1.6%～9.8%,枸杞中回收率為71.4%～112.54%,RSD為1.8%～9.7%,均滿足農(nóng)藥殘留檢測對(duì)回收率和精密度的要求。

表3 人參、金銀花、枸杞樣品回收率和RSD

2.4 儀器適用性 試驗(yàn)過程中手動(dòng)QuEChERS方法一人一天可以處理24個(gè)樣品,但自動(dòng)前處理樣品平臺(tái)一天可以處理72個(gè)樣品,且運(yùn)行過程中無需人員操作。將全自動(dòng)前處理平臺(tái)連續(xù)運(yùn)行3 d,無故障出現(xiàn),說明該儀器運(yùn)行穩(wěn)定性良好。為進(jìn)一步驗(yàn)證全自動(dòng)儀器適用性,將全自動(dòng)儀器應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測中,根據(jù)廈門鑒科檢測技術(shù)有限公司實(shí)際使用儀器一個(gè)月后反饋,使用全自動(dòng)儀器可以大幅度增加處理樣品量,減少人工成本,隨著使用時(shí)間增加,全自動(dòng)樣品前處理的優(yōu)勢更為顯著,一位員工在一個(gè)月手動(dòng)處理了624個(gè)樣品,但使用全自動(dòng)儀器一個(gè)月處理了2 040個(gè)樣品,結(jié)果見圖10。樣品前處理自動(dòng)化不僅能降低實(shí)驗(yàn)室人員的勞動(dòng)強(qiáng)度、提高樣品處理通量,還可以排除人為操作可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤,提高結(jié)果的重現(xiàn)性,同時(shí)樣品前處理自動(dòng)化可以減少實(shí)驗(yàn)人員接觸有毒有害的樣品和有機(jī)溶劑,最大限度保護(hù)人員的安全。

圖10 手動(dòng)和自動(dòng)樣品處理量

3 結(jié)論

本研究比較手動(dòng)和自動(dòng)QuEChERS對(duì)中藥中35種農(nóng)藥提取凈化的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參基質(zhì)中35種禁用農(nóng)藥有88.6%的農(nóng)藥手動(dòng)與自動(dòng)的回收具有顯著性差異,80%的農(nóng)藥自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng)回收率,金銀花參基質(zhì)中35種禁用農(nóng)藥有37.1%的農(nóng)藥手動(dòng)與自動(dòng)的回收具有顯著性差異,34.2%的農(nóng)藥自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng)回收率,枸杞參基質(zhì)中35種禁用農(nóng)藥有14.3%的農(nóng)藥手動(dòng)與自動(dòng)的回收具有顯著性差異,11.4%的農(nóng)藥自動(dòng)回收率優(yōu)于手動(dòng)回收率,3種基質(zhì)的手動(dòng)和自動(dòng)回收率具有顯著性差異的農(nóng)藥超過80%是自動(dòng)回收率大于手動(dòng),其余農(nóng)藥手動(dòng)和自動(dòng)的回收率無顯著性差異,并且除殺蟲脒外均能滿足分析檢測對(duì)回收率要求。因此,全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)能代替手動(dòng)QuEChERS前處理應(yīng)用于中藥禁用農(nóng)藥的檢測。全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)可以將原本復(fù)雜冗長的過程變得簡單易用,能夠滿足樣品前處理快速、高通量、自動(dòng)化的需求。在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)建立全自動(dòng)QuEChERS法測定人參、金銀花和枸杞樣品中35種農(nóng)藥殘留。