N-9,10-蒽醌-2-甲?；奖彼嶂委煷笫笸达L性關(guān)節(jié)炎的作用及機制

王偉,高天舒,湯同軍,賈昱晗,裴乃琪,錢有橋,趙嘉鑫,丁驍鵬,葛昊,張波,李洪雷,王星

(1.句容市人民醫(yī)院骨科,江蘇 句容 212400;2.中國藥科大學藥學院藥理系,江蘇 南京 211198;3.中國藥科大學基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床藥學學院,江蘇 南京 211198;4.中國藥科大學中藥學院,江蘇 南京 211198;5.南京醫(yī)科大學康達學院藥學部,江蘇 連云港 222000)

痛風性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis,GA)是由高尿酸血癥引起的炎性關(guān)節(jié)炎中最常見形式,其發(fā)病率逐年增加[1]。血液中尿酸(uric acid,UA)過高就會形成尿酸鈉(monosodium urate,MSU)晶體,當超過飽和點時,會沉積在關(guān)節(jié)腔和軟組織中引發(fā)急性炎癥反應(yīng)[1],通常表現(xiàn)為極度疼痛和關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。此外,它還可能導致永久性組織損傷,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨不可逆轉(zhuǎn)的損傷,對GA患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響。

蒽醌(anthraquinone,AQ),也稱為9,10-蒽醌,是指在C9和C10具有羰基的蒽醌化合物,是多環(huán)芳香烴衍生物,通常存在于高等植物如遼科、鼠李科、茜草科、百合科以及中藥如大黃、蘆薈、雷公藤等,具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等重要藥理作用[2]。N-9,10-蒽醌-2-甲?；奖彼?NAY)在活性口袋中呈扁平構(gòu)象,發(fā)揮了苯腈部分與非布司他親脂尾部的良好結(jié)合作用[3],前期研究證明,NAY對高尿酸血癥小鼠具有降低UA的作用,同時還可以降低血清肌酐(creatinine,CRE)和尿素氮(urea nitrogen,BUN)及炎癥因子的因子的表達,具有降尿酸和抗炎的雙重功效,對腎臟具有保護作用[4]。但其對GA的治療作用目前研究較少。因此,本研究采用MSU誘導體內(nèi)和體外GA模型,分析NAY治療GA的效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器 NAY參照文獻方法合成[3-4];秋水仙堿購自MCE公司;別嘌呤醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;MSU購自Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)抑制劑MCC950購自Selleck公司;UA、CRE和BUN檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司;大鼠白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司;胎牛血清、青-鏈霉素購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher Scientific公司;NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1,caspase-1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及相關(guān)二抗購自Abcam公司。INFINITE 200 PRO多功能酶標儀購自瑞士帝肯公司;BS/BT124S電子天平購自德國賽多利斯公司;CF1524R臺式高速冷凍型微量離心機購自北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司;101-2BS電熱恒溫干燥箱購自上海尚道儀器制造有限公司;Heracell Vios 160i CR二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠56只購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)-2018-0006),統(tǒng)一飼養(yǎng)在標準屏障系統(tǒng)動物房中,溫度(22±2)℃,濕度40%～60%,每天12 h的光照,晝夜交替。動物實驗符合國家實驗動物福利指南及實驗動物倫理規(guī)范。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的大鼠腹部巨噬細胞在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5%二氧化碳的加濕培養(yǎng)箱中孵育。

1.3.2 細胞造模和分組 將細胞分成空白組、模型組(100 μg·mL-1的MSU處理)、NAY組(100 μg·mL-1的MSU+40 μg·mL-1的NAY)、MCC950組(100 μg·mL-1的MSU+8 μg·mL-1的MCC950)、聯(lián)合給藥組(100 μg·mL-1的MSU+40 μg·mL-1的NAY +8 μg·mL-1的MCC950),空白組和模型組各加200 μL培養(yǎng)基,孵育24 h后去掉上清,模型組和各給藥組加入100 μg·mL-1的MSU 200 μL,空白組加入200 μL培養(yǎng)基,孵育24 h后進行后續(xù)實驗。其中上清液用于炎癥因子-TNF-α和IL-1β的檢測,提取細胞總蛋白用于后續(xù)Western blot實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 關(guān)節(jié)腫脹度的計算 在MSU晶體注射后0、12、24和48 h,通過軟尺測量踝關(guān)節(jié)周長來量化炎癥。踝關(guān)節(jié)腫脹程度按以下公式計算：關(guān)節(jié)腫脹度(%)=(各時間點注射MSU晶體后踝關(guān)節(jié)周長/大鼠踝關(guān)節(jié)初始周長-1)×100%。

1.4.2 血清中UA、CRE和BUN含量的測定 注射MSU晶體后48 h,將大鼠進行麻醉,然后大鼠摘眼球采集血樣。靜置1 h后,用3 000 r·min-1的速度進行15 min的離心,然后收集血清樣本,按照試劑盒說明書進行大鼠血清UA、CRE和BUN含量的測定。

1.4.3 血清、關(guān)節(jié)滑膜和細胞上清液中TNF-α和IL-1β含量 將上述取血后的大鼠置于冰臺上,快速解剖,在以踝關(guān)節(jié)為中心上下1 cm處剪斷,取下受試關(guān)節(jié)周圍軟組織,并剝離踝關(guān)節(jié)周圍的肌肉等組織,沿踝關(guān)節(jié)骨周圍分離整塊滑膜,并分割成條狀,稱量,按1∶5(m/V)比例加磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),冰浴勻漿,離心5 min后,取上清液分裝于EP管中,置-80 ℃冰箱保存待測。按照ELISA試劑盒說明書測定血清、關(guān)節(jié)滑膜和細胞上清液中TNF-α和IL-1β含量,BCA法測定關(guān)節(jié)滑膜蛋白水平,用炎癥因子水平比上蛋白水平即關(guān)節(jié)滑膜炎癥因子相對含量。

1.4.4 大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織病理學檢測 解剖大鼠的整個踝關(guān)節(jié)及周圍軟組織,立即放入新配制的10%中性甲醛溶液固定24 h,切片,HE染色,觀察關(guān)節(jié)周圍軟組織的病理學變化情況。

1.4.5 細胞活力檢測 取處于對數(shù)生長期的巨噬細胞懸液,將細胞液濃度稀釋調(diào)節(jié)至105mL-1,在96孔板每孔加入細胞懸液100 μL,再加入培養(yǎng)基100 μL,在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h;然后吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌3次,加入含NAY或MSU的培養(yǎng)液,NAY終濃度分別為5、10、20、40、80 μg·mL-1,MSU終濃度為12.5、25、50、100、200 μg·mL-1,置于5%二氧化碳、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸出培養(yǎng)液,用PBS漂洗3次,加入CCK-8檢測液,再將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中,37 ℃孵育3 h,在450 nm處檢測OD值,計算細胞活力。

1.4.6 Western blot實驗 使用RIPA裂解液提取關(guān)節(jié)滑膜和細胞蛋白質(zhì),蛋白提取物通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,并在室溫下用含有吐溫-20 Tris緩沖鹽(Tris buffered saline plus tween-20,TBST)的10%脫脂奶粉封閉1h。將膜與適當?shù)囊豢乖? ℃下孵育過夜,如下所示：NLRP3(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。用TBST洗滌膜,并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)使蛋白質(zhì)條帶可視化,并使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理結(jié)果用mean±SEM表示。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析,LSD法進行組間統(tǒng)計學差異分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NAY對MSU所致GA大鼠體重和踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 如表1所示,與正常組相比,模型組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腫脹度在造模12、24和48 h后顯著增加(P<0.001),表明GA大鼠模型造模成功。造模組大鼠在造模后關(guān)節(jié)腫脹度呈上升趨勢,在24 h達到最高。與模型組相比,秋水仙堿組造模后48 h右后足踝關(guān)節(jié)腫脹情況明顯改善(P<0.01),別嘌呤醇組大鼠在24 h和48 h關(guān)節(jié)腫脹度也有下降趨勢(P<0.01)。NAY給藥組在造模12 h(低、中劑量：P<0.05,高劑量：P<0.001)、24 h(低、中劑量：P<0.01,高劑量：P<0.001)和48 h(中劑量：P<0.05,高劑量：P<0.001)均可不同程度改善GA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度;且各組大鼠之間體重沒有顯著差異。

表1 NAY對MSU所致GA大鼠體重和踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

2.2 NAY對MSU所致GA大鼠血清生化指標的影響 如圖1所示,與正常組相比,模型組大鼠血清UA(P<0.001)、CRE(P<0.05)和BUN(P<0.05)含量顯著上升,秋水仙堿組相比于模型組,血清CRE(P<0.05)和BUN(P<0.01)含量顯著降低,而別嘌呤醇顯著降低大鼠血清UA(P<0.001)和BUN(P<0.01)水平。NAY各個劑量組均顯著降低GA大鼠血清UA(低劑量：P<0.05;中劑量：P<0.01;高劑量：P<0.001)、CRE(低劑量：P<0.05;中劑量：P<0.01;高劑量：P<0.001)和BUN(低劑量：P<0.001;中劑量：P<0.05;高劑量：P<0.001)水平。

圖1 NAY對MSU所致GA大鼠血清UA(A)、CRE(B)和BUN(C)含量的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=6;與正常組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;***P<0.001

2.3 NAY對MSU所致GA大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜中炎癥因子的影響 如圖2所示,與正常組相比,模型組大鼠血清中的TNF-α和IL-1β的含量顯著升高(P<0.001)。秋水仙堿和別嘌呤醇可以顯著降低GA大鼠血清中IL-1β水平(P<0.001),NAY各劑量組可顯著降低GA大鼠血清中TNF-α(中劑量：P<0.05;高劑量：P<0.01)和IL-1β(P<0.001)水平。

圖2 NAY對MSU所致GA大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜TNF-α(A.血清;C.關(guān)節(jié)滑膜)和IL-1β(B.血清;D.關(guān)節(jié)滑膜)含量的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=6;與正常組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

與正常組相比,模型組關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α和IL-1β的含量顯著上升(P<0.05),NAY高劑量組可以顯著降低GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中炎癥因子TNF-α水平(P<0.05),而NAY中(P<0.05)、高(P<0.01)劑量組可以顯著降低GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中炎癥因子IL-1β水平。

2.4 NAY對MSU所致GA大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織病理學影響 如圖3所示,與模型組相比,正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細胞排列整齊,形態(tài)正常,關(guān)節(jié)腔中未見炎性細胞浸潤,而模型組大鼠踝關(guān)節(jié)有大面積炎性細胞浸潤,關(guān)節(jié)間隙狹窄,結(jié)締組織、滑膜細胞增生,關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞嚴重。秋水仙堿組和別嘌醇組大鼠踝關(guān)節(jié)組織可見少量炎癥細胞,但關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常。NAY各個劑量給藥組炎性細胞浸潤、細胞排列等均有不同程度的改善。

A.正常組;B.模型組;C.NAY低劑量組(20 mg·kg-1);D.NAY中劑量組(40 mg·kg-1);E.NAY高劑量組(80 mg·kg-1);F.秋水仙堿組;G.別嘌呤醇組圖3 NAY對MSU所致GA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學的影響(HE染色,×200)

2.5 NAY對MSU所致GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3炎癥小體的影響 如圖4所示,GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達增加(P<0.001),而NAY能顯著降低GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3(中劑量：P<0.01;高劑量：P<0.001)、ASC(中劑量：P<0.01;高劑量：P<0.001)和caspase-1(中劑量：P<0.05;高劑量：P<0.01)的蛋白表達。

圖4 NAY對MSU所致GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3(A、B)、ASC(A、C)和caspase-1(A、D)蛋白表達的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=4;與正常組比較,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.6 NAY和MSU對大鼠巨噬細胞活力的影響 如圖5所示,NAY濃度在5、10、20、40 μg·mL-1時,各組細胞活力與空白組相比,沒有顯著性差異,且濃度在40 μg·mL-1以內(nèi)是細胞活力均在96%以上;同時與空白組相比,12.5(P<0.01)、25(P<0.001)、50(P<0.001)、100(P<0.001)、200 μg·mL-1(P<0.001)的MSU均顯著降低大鼠巨噬細胞活力,后續(xù)為了檢測NAY的藥效,造模后細胞活力在40%～60%之間為宜,因此后續(xù)實驗中MSU濃度選擇100 μg·mL-1,NAY給藥濃度選擇40 μg·mL-1。

圖5 NAY(A)和MSU(B)對大鼠巨噬細胞活力的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=5;與空白組比較,**P<0.01,***P<0.001

2.7 NAY和MCC950對MSU誘導大鼠巨噬細胞活力及上清液炎癥因子的影響 如圖6所示,與空白組相比,MSU誘導大鼠巨噬細胞活力顯著下降(P<0.001),上清液TNF-α和IL-1β含量顯著上升(P<0.001),而NAY、MCC950(NLRP3抑制劑)和聯(lián)合給藥組均可顯著提高大鼠巨噬細胞活力(P<0.01),降低大鼠巨噬細胞上清液TNF-α和IL-1β的含量(P<0.001),但是聯(lián)合給藥組與MCC950組相比,兩組之間細胞活力、TNF-α和IL-1β含量沒有顯著性差異。

圖6 NAY和MCC950對MSU誘導大鼠巨噬細胞活力(A)、上清液TNF-α(B)和IL-1β(C)的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=5;與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,***P<0.001

2.8 NAY和MCC950對MSU誘導大鼠巨噬細胞NLRP3炎癥小體的影響 如圖7所示,與空白組相比,模型組NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達顯著升高(P<0.001),而NAY、MCC950和聯(lián)合給藥組均可顯著降低模型組NLRP3(NAY組：P<0.01;MCC950和聯(lián)合給藥組：P<0.001)、ASC(NAY組：P<0.01;MCC950和聯(lián)合給藥組：P<0.001)和caspase-1蛋白表達(NAY組：P<0.05;MCC950和聯(lián)合給藥組：P<0.01),但是聯(lián)合給藥組與MCC950組相比,兩組之間NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達沒有顯著性差異。

圖7 NAY和MCC950對MSU誘導大鼠巨噬細胞NLRP3(A、B)、ASC(A、C)和caspase-1(A、D)蛋白表達的影響 注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SEM表示,n=4;與正常組比較,###P<0.00;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

急性GA是一種常見的代謝性疾病,特征是突然的顯著的關(guān)節(jié)疼痛,具有非常復(fù)雜的機制。在臨床上,通常通過控制UA的水平來對GA進行預(yù)防和治療,目前,通過藥物降低血清UA濃度是預(yù)防GA最有效的手段。作為產(chǎn)生UA過程中的速率限制酶,黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性直接影響人體內(nèi)UA的生成。因此,XOD抑制劑,如別嘌呤醇和非布司他已成為GA治療的一線藥物[5]。然而,傳統(tǒng)的XOD抑制劑雖然可顯著降低血清UA水平,但是會導致一系列的副作用[6]。同時,XOD抑制劑對于GA急性發(fā)作的治療效果較差。因此,探索治療GA的新策略對患者和社會都具有重要意義。

本研究將MSU晶體注射入大鼠關(guān)節(jié)腔中誘發(fā)了急性GA,建立了大鼠GA模型。當MSU晶體析出后,關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部的單核細胞、滑膜細胞和巨噬細胞等相互作用并產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì),引發(fā)集聚的炎癥反應(yīng),且炎性介質(zhì)進一步促進中性粒細胞的聚集并產(chǎn)生促炎因子、蛋白溶酶和氧自由基等,從而加重炎癥和關(guān)節(jié)破壞,使得關(guān)節(jié)液量急劇增加,最終導致關(guān)節(jié)滑膜增生和肥厚[7]。研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯增大,說明GA模型復(fù)制較為成功。與模型組相比NAY給藥各劑量組均能減小GA大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹度,說明NAY對GA大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹情況有很好的改善作用。NAY作為XOD抑制劑可以明顯降低大鼠血清UA水平,進而抑制尿酸鹽的沉積,治療大鼠GA。通過檢測大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜TNF-α和IL-1β水平,發(fā)現(xiàn)NAY可以降低GA大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜炎性因子水平,且發(fā)現(xiàn)NAY可以減少從大鼠腹部分離的原代巨噬細胞中MSU誘導的IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生,同時前期研究發(fā)現(xiàn)NAY可以降低高尿酸血癥小鼠和細胞中IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達[3],表明NAY可能通過抑制關(guān)節(jié)周圍組織中的炎癥反應(yīng)來改善GA。

NLRP3炎癥小體是先天免疫的重要組成部分,其失調(diào)與多種炎癥性疾病密切相關(guān),其由NLRP3、ASC和caspase-1組成[8]。NLRP3炎癥小體在激活物的作用下誘導蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成,促進前體(pro)-caspase-1裂解成其活性形式,活化的caspase-1裂解pro-IL-1β后產(chǎn)生成熟的IL-1β。NLRP3炎癥小體和IL-1β是痛風發(fā)作期間重要的炎癥觸發(fā)因素[9]。MSU晶體可以激活NLRP3炎癥小體并促進前體pro-IL-1β的成熟[10]。IL-1β可誘導中性粒細胞浸潤到關(guān)節(jié)中,導致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛[11]。蒽醌類化合物具有廣泛的藥理活性,研究發(fā)現(xiàn)蒽醌類化合物大黃酸可以抑制MSU誘導的GA中NLRP3炎癥小體的激活[12],且前期研究也證實NAY可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活緩解高尿酸血癥引起的腎臟損傷[3]。本研究發(fā)現(xiàn),NAY可以降低GA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達;而在細胞實驗中,MSU誘導了大鼠巨噬細胞NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達,MCC950是NLRP3的抑制劑,可以抑制NLRP3的活性,在本研究中,發(fā)現(xiàn)分別加入NAY或MCC950后都可以顯著降低由于MSU誘導引起的TNF-α、IL-1β、NLRP3、ASC和caspase-1的過表達,同時發(fā)現(xiàn)NAY+MCC950聯(lián)合用藥后也可以改善上述異常的指標,但與MCC950組相比,兩組之間的指標沒有顯著性差異。

總之,本研究表明NAY可在體內(nèi)和體外有效預(yù)防MSU晶體誘導的GA,潛在機制與其降尿酸和調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體有關(guān),且前期研究表明NAY毒性較小,安全性較高,可能是一種很有前途的臨床預(yù)防和治療GA的藥物。