苦味素激活苦味受體引起支氣管擴(kuò)張的相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

陳宋程 卓懷蜜 周向東,2,3 李琪,2,3

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病,全球約3億人受其影響,氣流受限是慢阻肺、支氣管哮喘等阻塞性疾病的共同特征,急性發(fā)作時(shí),常表現(xiàn)為持續(xù)氣道痙攣,可能導(dǎo)致呼吸衰竭、甚至窒息猝死,支氣管平滑肌主動(dòng)收縮所致氣道阻塞是患者死亡的重要因素[1]。

G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是人類基因組中最大的受體超家族,是真核生物中最大和最多樣化的膜受體組,能被光能、脂質(zhì)、糖、肽和蛋白質(zhì)形式的多種配體激活,將來自外部環(huán)境的信息傳遞到細(xì)胞中,以調(diào)節(jié)其相應(yīng)的功能[2]?？辔妒荏w是眾多G蛋白偶聯(lián)受體中的一員,其大約有25個(gè)功能性的編碼苦味受體蛋白的基因,這些編碼基因除了存在于口腔和咽喉,還存在于內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、呼吸等眾多系統(tǒng)[3]。苦味素是中草藥成分中除了生物堿和苷類以外具有苦味性質(zhì)的一類化合物的通稱,是苦味受體的有效激動(dòng)劑。研究證實(shí)了TAS2R受體在人類氣道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)上的表達(dá),并將苦味受體的表達(dá)與Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)相聯(lián)系,發(fā)現(xiàn)苦味素可逆轉(zhuǎn)Ca2+變化引起的支氣管收縮從而擴(kuò)張支氣管[4]?？辔端丶?dòng)TAS2R受體可逆性的擴(kuò)張慢性氣道炎癥引起的氣道收縮,這預(yù)示著TAS2R受體有著不可低估的支氣管擴(kuò)張潛力,苦味素或許能成為一類用于治療哮喘和慢阻肺的具有強(qiáng)效擴(kuò)張支氣管的新型藥物[5]。

一、TAS2R受體結(jié)構(gòu)及其擴(kuò)張支氣管的研究背景

TAS2Rs受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員:由一條多肽鏈形成的7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)組成,包含相應(yīng)的3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和3個(gè)內(nèi)環(huán)。外環(huán)較短,具有明顯的多態(tài)性[6],可結(jié)合多種苦味物質(zhì)(即配體);內(nèi)環(huán)高度保守,是細(xì)胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)區(qū)域。與TAS2R受體偶聯(lián)的是一種特異性的苦味信號(hào)偶聯(lián)蛋白:味導(dǎo)素(gustducin),味導(dǎo)素由α、β、γ三條不同的多肽鏈組成,具有GTP酶活性和GTP結(jié)合位點(diǎn)[7](見圖1)。人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TAS2R受體包含一個(gè)單一的結(jié)合位點(diǎn),該結(jié)合位點(diǎn)以非選擇性方式廣泛調(diào)整多種苦味配體,因此不同的苦味食物結(jié)合TAS2Rs后可以引起相似的苦味覺。

圖1 苦味受體示意圖

起初,Einstein等人通過使用表達(dá)微陣列對(duì)來自五個(gè)不同個(gè)體的ASM細(xì)胞進(jìn)行RNA分離和分析,發(fā)現(xiàn)在這五個(gè)不同個(gè)體的ASM細(xì)胞內(nèi)都存在顯著的GPCR基因表達(dá)[8]。隨后,Deepak A. Deshpande及其團(tuán)隊(duì)對(duì)人類氣道平滑肌細(xì)胞進(jìn)行了廣泛的GPCR篩選工作,通過定量RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有多種TAS2R受體亞型在氣道平滑肌上存在表達(dá),其中,TAS2R10、TAS2R14和TAS2R31是ASM細(xì)胞中表達(dá)量最高的亞型[9],與編碼β2腎上腺素能受體的ADRB2基因相比,表達(dá)量要高3～4倍。此外,研究者們也從豚鼠和小鼠ASM細(xì)胞中檢測(cè)到了TAS2Rs受體,這為研究TAS2Rs受體在ASM細(xì)胞中的作用提供了較好的體內(nèi)和離體模型。研究發(fā)現(xiàn),在ASM細(xì)胞中,利用苦味素激活TAS2R受體,可觀察到ASM細(xì)胞內(nèi)Ca2+有明顯增加,且Ca2+瞬變的幅度與味導(dǎo)素α偶聯(lián)的支氣管收縮劑、組胺和緩激肽引起的幅度相當(dāng)。證實(shí)了ASM細(xì)胞上苦味受體的表達(dá)[4],并將表達(dá)與苦味劑介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)聯(lián)系起來。

二、苦味素激活苦味受體舒張支氣管的研究進(jìn)展

環(huán)境污染物中可能含有苦味化合物,其可能與氣道中的TAS2R結(jié)合,通過引發(fā)跨物種的先天厭惡反應(yīng)來防止攝入有毒物質(zhì)[10],起初人們認(rèn)為,ASM細(xì)胞內(nèi)Ca2+在TAS2R被苦味化合物激活后內(nèi)流增加會(huì)導(dǎo)致ASM收縮,從而對(duì)吸入的有毒物質(zhì)產(chǎn)生生理排斥,但Di Pizio等人卻發(fā)現(xiàn)了不一樣的結(jié)果。他們運(yùn)用卵清蛋白致敏,建立慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的小鼠模型,通過吸入氯喹、糖精和地那銨等幾種已知的苦味受體激動(dòng)劑后,發(fā)現(xiàn)小鼠ASM細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加,在運(yùn)用免疫熒光共聚焦成像、膜電位測(cè)定、Q-PCR、小鼠肺功能檢測(cè)、WestBlot等方法檢測(cè)后,結(jié)果顯示吸入苦味受體激動(dòng)劑后小鼠出現(xiàn)了顯著的氣道擴(kuò)張,其氣道擴(kuò)張效果比傳統(tǒng)的β-激動(dòng)劑在同種模型氣道中的擴(kuò)張作用高約3倍[11]?？辔妒荏w激動(dòng)劑激活 ASM 細(xì)胞上的TAS2R會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的支氣管擴(kuò)張這一現(xiàn)象,引起了學(xué)術(shù)界和制藥業(yè)研究人員的注意以及對(duì)其內(nèi)在機(jī)制的探索。

1 ASM上TAS2R受體的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白

先前的研究已經(jīng)明確苦味素可通過激活A(yù)SM細(xì)胞上的苦味受體引起氣道擴(kuò)張,但其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中是依靠何種G蛋白來介導(dǎo)激動(dòng)劑與苦味受體結(jié)合仍需探討。典型的TAS2R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)分子在苦甜和鮮味受體之間共享,包括異源三聚體G蛋白亞基(Gα,Gβ3,和Gγ13)、磷脂酶C(Phospholipaseβ2,PLCβ2)、肌醇1,4,5-三磷酸受體(Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor 3,IP3R3)和TRPM5離子通道[12]。許多苦味激活物被認(rèn)為與味覺細(xì)胞上特定的G蛋白偶聯(lián)膜受體結(jié)合,如苦味受體的同源G蛋白α-味覺誘導(dǎo)素。α-味覺誘導(dǎo)素是一種獨(dú)特的G蛋白,在約30%的II型味覺受體細(xì)胞(Taste receptor cell,TRC)中選擇性表達(dá)[13],與視網(wǎng)膜蛋白α-味覺誘導(dǎo)素有80%的同一性,研究認(rèn)為其在甜味和苦味受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色。通過結(jié)合Ca2+成像和免疫組織化學(xué),發(fā)現(xiàn)小鼠味蕾中大約一半的苦味敏感味覺細(xì)胞表達(dá)α-味覺誘導(dǎo)素,而G蛋白α-味覺誘導(dǎo)素敲除的小鼠的苦味敏感味覺細(xì)胞減少40到100倍,其苦味反應(yīng)細(xì)胞對(duì)苦味激動(dòng)劑的敏感性也降低8到10倍[14]。在人類ASM細(xì)胞中,通過G蛋白α-味覺誘導(dǎo)素的耦合來實(shí)現(xiàn)氣道平滑肌苦味受體在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和松弛[15]。

2 ASM上TAS2R的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

ASM上TAS2R被激活后的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全明確,Deshpande等人提出苦味物質(zhì)激活典型途徑:TAS2Rs激活G蛋白-味覺誘導(dǎo)素的β、γ亞基,形成Gβγ-復(fù)合物,Gβγ-復(fù)合物激活磷脂酶C異構(gòu)體β2,然后誘導(dǎo)肌醇 1,4,5-三磷酸和二?；视?DAG)的產(chǎn)生。IP3通過反向結(jié)合細(xì)胞內(nèi)離子通道IP3受體[16],從而釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)中的Ca2+[17]。另有研究者認(rèn)為,苦味素逆轉(zhuǎn)了支氣管收縮劑引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加,這種逆轉(zhuǎn)效應(yīng)是通過抑制l型電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channels,VDCCs)介導(dǎo)的。TAS2R被苦味素刺激后,激活G蛋白α-味覺誘導(dǎo)素及效應(yīng)磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs),引起鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Cam)水平下降和蛋白激酶A(protein kinases A,PKA)活性降低[18],使三磷酸肌醇受體3對(duì)Ca2+通道的抑制作用削減,致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放。以上兩種機(jī)制均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+的釋放,增加的細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活基底外側(cè)質(zhì)膜中的瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M成員4和5(Transient receptor potential M4/5,TRPM4/5),導(dǎo)致膜去極化,觸發(fā)Na+動(dòng)作電位放電,以及誘導(dǎo)ATP釋放。反過來,ATP作為主要的神經(jīng)遞質(zhì)刺激傳入顱神經(jīng)上的嘌呤能受體2和3(P2X2和P2X3 Purinergic P2 Receptor)[18-19],激活觸發(fā)動(dòng)作電位,隨后激活大腦中的味覺皮層。

通過探索苦味素刺激TAS2R引起氣道擴(kuò)張的機(jī)制,有研究者在上述兩種經(jīng)典途徑的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),由苦味劑引起的人ASM細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加不依賴于細(xì)胞外 Ca2+的存在,并觀察到苦味素預(yù)處理幾乎消除了MCh誘導(dǎo)的ASM細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高,從而抑制了鈣誘導(dǎo)的收縮效應(yīng)[20],但該反應(yīng)可被Gβγ抑制劑、PLCβ抑制劑消除,并被3-磷酸肌醇受體拮抗劑部分抑制(見圖2)。

三、苦味受體激動(dòng)劑的篩選及擴(kuò)張潛能

與其他GPCR相比,苦味受體與多種結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)相互作用的能力非常顯著,包括多種藥物/抗生素、多酚、細(xì)菌代謝物、鹽和金屬離子[21],因此,探索尋找具有顯著選擇性的高度異質(zhì)苦味化合物是目前研究的重點(diǎn)方向和主要挑戰(zhàn)。2019年有研究者首次使用電子細(xì)胞基質(zhì)阻抗傳感器(Electric Cell-substrate Impedance Sensing,ECIS)建立了檢測(cè)ASM收縮/松弛效應(yīng)的方法,篩選出的奎寧、諾比列素和苦味菌素IA均能有效抑制平滑肌收縮,且呈濃度依賴性[22]。盡管已鑒定出上千種苦味物質(zhì),但迄今為止研究的其他苦味物質(zhì)中,多數(shù)的支氣管舒張效果及安全性并不理想。典型的氯喹和其類似化合物被認(rèn)為對(duì)TAS2R無特異選擇性。denatonium(地托丹寧)會(huì)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞(airway epithelial cell,AEC)的凋亡,這可能損害上皮完整性,甚至增加了冠狀病毒及其他有害顆粒物入侵機(jī)體的風(fēng)險(xiǎn)[23],故需仔細(xì)評(píng)估其對(duì)氣道上皮的潛在毒性。另有研究表明柚皮苷對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖作用可能與細(xì)胞周期的增強(qiáng)、細(xì)胞周期素E mRNA的表達(dá)和鈣信號(hào)的激發(fā)有關(guān),使用特異性阻斷劑抑制TAS2R表達(dá)和TAS2R信號(hào)通路均可減弱柚皮苷的促增殖作用[24]。柚皮苷對(duì)氣道上皮有足夠的安全性,但至少需在幾百微摩爾濃度下發(fā)揮作用,這限制了其在臨床上的應(yīng)用。

圖2 苦味素激動(dòng)苦味受體的信號(hào)傳導(dǎo)通路

2020年有研究者發(fā)現(xiàn)體外低濃度的血根堿SA(低于1μM)能夠以劑量依賴的方式舒張大鼠ASM,通過抑制Gβγ、PLCβ、3-磷酸肌醇受體可減弱ASM的舒張反應(yīng),表明SA可能依賴于TAS2R/Gβγ/PLCβ信號(hào)途徑誘導(dǎo)ASM松弛[25]。但目前已知SA對(duì)心肌中的Na+,K-ATP酶具有抑制作用,在大鼠心房中引起正性肌力作用,表明SA可能對(duì)心肌細(xì)胞存在毒性作用[26],這可能也是引起ASMC損害的危險(xiǎn)因素,故在將來的研究中需要仔細(xì)評(píng)估SA在臨床應(yīng)用中的安全性。

苦丁苷(KE-A)是從苦丁茶中提取的一類具有典型五環(huán)三萜和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的苦味化合物[27],是一種有效的TAS2R激動(dòng)劑。有研究者建立了大鼠ASM原代細(xì)胞TAS2R10和TAS2R14細(xì)胞模型,用30μM氯喹和30μM KE-A培養(yǎng),可觀察大鼠ASM原代細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加,KE-A組的鈣離子增加程度與氯喹組相類似[7,28],再用Mch刺激,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高被明顯抑制,結(jié)果表明,TAS2R激活誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣水平輕微升高,但不足以誘導(dǎo)味覺受體細(xì)胞磷酸化,而顯著抑制了MCh介導(dǎo)的鈣釋放[29]。但目前研究?jī)H限于KE-A對(duì)體外大鼠ASMC的影響,需要進(jìn)一步在體外測(cè)定KE-A對(duì)人ASMC的影響以及在體內(nèi)的作用,以確定KE-A在擴(kuò)張支氣管作用上的潛在價(jià)值。

四、結(jié)語

本文對(duì)代表性苦味中藥組分介導(dǎo)支氣管舒張的相關(guān)分子機(jī)制做了詮釋,同時(shí)淺析目前具有代表性的中藥組分在舒張支氣管方面的潛能,有助于從傳統(tǒng)中藥中尋找有效的單體成分,為拓展其科學(xué)應(yīng)用提供新的思路,也為慢性氣道炎癥性疾病的防治提供了新思路。

隨著研究的深入,苦味受體激動(dòng)劑舒張支氣管的機(jī)制將會(huì)逐漸明晰,TAS2R激動(dòng)劑作為治療阻塞性氣道疾病的新型高效支氣管擴(kuò)張劑顯示出良好的前景,但也存在巨大的挑戰(zhàn)。TAS2R亞型之間存在高度同源的序列,篩選出具有高度特異性的化合物是目前急需解決的難題,有日本學(xué)者運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法來確定每種TAS2R亞型的基因表達(dá),但其量化的基因亞型有限,且會(huì)受到來自其他亞型的干擾[30];此外,尋求更加高效的苦味化合物、如何避免藥物脫靶以及更合適的給藥形式仍需要進(jìn)一步探索。