miR-526b-3p調(diào)控TROAP基因介導(dǎo)Wnt信號通路對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲遷移的影響

鄧科蘭 劉桂霞

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者目前預(yù)后并不理想,探究其發(fā)生機(jī)制具有積極臨床意義[1-2]。miR-526b-3p介導(dǎo)膠質(zhì)瘤、NSCLC等多種癌細(xì)胞生物學(xué)行為[3],可抑制肝癌和NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4-5]。滋養(yǎng)素相關(guān)蛋白(trophinin-associated protein,TROAP)具有致癌作用,抑制其表達(dá)可減弱腎透明細(xì)胞癌和NSCLC細(xì)胞的存活、遷移和侵襲潛能[6-7]。Wnt信號在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,抑制其激活可顯著抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡[8-9]。TROAP可通過激活Wnt/β-Catenin通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[10]。查詢TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-526b-3p與TROAP間有結(jié)合位點,因此推測miR-526b-3p可能通過調(diào)控TROAP基因介導(dǎo)Wnt信號,進(jìn)而影響NSCLC細(xì)胞的增殖與侵襲遷移過程。本文以miR-526b-3p模擬物干預(yù)處理體外培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549,對以上推測進(jìn)行驗證研討。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

A549細(xì)胞(CL-0016)、人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(CP-H209)、NCI-H1299細(xì)胞(CL-0165)、HCC827細(xì)胞(CL-0094)、特級胎牛血清(164210-500)、人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-H209)、含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液(PB180225)、RPMI-1640培養(yǎng)基(PM150110)、Ham′s F-12K培養(yǎng)基(PM150910)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液(YC-5008)、Opti-MEM I培養(yǎng)基(YC-3039A),購自上海語純生物科技有限公司;實驗所用miR-526b-3p模擬物、各種質(zhì)粒及各基因引物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;ANNEXIN V- FITC/PI凋亡檢測試劑盒(CA1020)、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(CA1170)、總RNA提取試劑盒(R1200)、Hoechst 33258染色液(10 μg/mL,C0020)、一步法實時熒光定量PCR試劑盒(T2210)、基底膠(356234)、LipofectamineTM2000(11668)、結(jié)晶紫染色液(G1062)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(D0010),購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗人Anti-Cyclin D1一抗(ab134175)、兔抗人Anti-Bax一抗(ab182733)、兔抗人Anti-Caspase-3一抗(ab184787)、兔抗人Anti-Vimentin一抗(ab92547)、兔抗人Anti-β-actin一抗(ab8227),購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、兔抗人Anti-E-cadherin一抗(AF6759)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(貨號A0216)、兔抗人Anti-β-tubulin一抗(AF1216)、兔抗人Anti-Wnt一抗(AF8349),購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠抗人Anti-TROAP一抗(H00010024-A01),購自艾美捷科技有限公司等。

超微量分光光度計(型號NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;生物顯微鏡(型號LW200)購自上海尖端光電科技有限公司;倒置熒光顯微鏡(型號NIB900-FL)購自上海悌可光電科技有限公司;熒光定量PCR儀(型號C1000)購自美國Bio-Rad公司等。

二、 檢測人肺泡上皮細(xì)胞及NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p及TROAP、Wnt基因的表達(dá)水平

于39.6℃水浴中快速解凍人肺泡上皮細(xì)胞及NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299,離心洗滌細(xì)胞沉淀后,人肺泡上皮細(xì)胞以其購買的完全培養(yǎng)基重懸混勻,HCC827、NCI-H1299細(xì)胞以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸混勻,A549細(xì)胞以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的Ham′s F-12K培養(yǎng)基重懸混勻,所有細(xì)胞均放入37.5℃,5%CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng),等細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時傳代培養(yǎng)。

收集傳代的人肺泡上皮細(xì)胞及NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299細(xì)胞沉淀,采用總RNA提取試劑盒并遵照其說明指導(dǎo)提取各細(xì)胞中的總RNA,經(jīng)超微量分光光度計測出其濃度后,采用一步法實時熒光定量試劑盒并遵照其說明指導(dǎo)做PCR擴(kuò)增,反應(yīng)后所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt分析計算,miR-526b-3p以U6做內(nèi)參,TROAP、Wnt基因以GAPDH做內(nèi)參,最終得出各基因相對表達(dá),各基因引物序列如下:GAPDH上游引物:5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′,下游引物:5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′;TROAP上游引物:5′-GGCAGGCCTCAGCAATCTG-3′,下游引物:5′-GGCATCCTGCCATTCGAGTA-3′;miR-526b-3p上游引物:5′-CTCTTGAGGGAAGCACT-3′,下游引物:5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGAC-3′,下游引物:5′-AACGCTTACGAATTT-3′;Wnt上游引物:5′-CATCTTCGCAATCACCTCCG-3′,下游引物:5′-GTGGCATTTGCACTCTTGG-3′。

E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,下游引物:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;Vimentin上游引物:5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′,下游引物:5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′;Bax上游引物:5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAGCT-3′,下游引物:5′-TCCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′;Caspase-3上游引物:5′-GGAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3′,下游引物:5′-CTTCTGGCAAGCCATCTCCTCA-3′;Cyclin D1上游引物:5′-TCTACACCGACAACTCCATCCG-3′,下游引物:5′-TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG-3′。

三、細(xì)胞處理及增殖、凋亡檢測

取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的24孔板中,隨機(jī)分為對照組、miR-526b-3p mimic組、miR-526b-3p mimic陰性對照組、miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組、miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組,采用LipofectamineTM2000并遵照其說明指導(dǎo)對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,miR-526b-3p mimic組、miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-526b-3p mimic及其陰性對照,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-526b-3p mimic和TROAP過表達(dá)質(zhì)粒,miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-526b-3p mimic和Wnt過表達(dá)質(zhì)粒,24 h后加入Edu染液孵育后固定細(xì)胞,具體步驟遵照Edu細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明指導(dǎo)進(jìn)行,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),以Edu陽性率=Edu陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%反映各組A549細(xì)胞增殖情況。

取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的24孔板中,以上述同樣的方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后,洗滌、固定細(xì)胞,以10 μg/mL的Hoechst 33258染色液孵育后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),以此判斷各組A549細(xì)胞凋亡情況;取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的24孔板中,以上述同樣的方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后,收集各組細(xì)胞并洗滌、計數(shù),每組取約2×105個細(xì)胞采用ANNEXIN V- FITC/PI凋亡檢測試劑盒按照其說明指導(dǎo)孵育FITC、PI后,上機(jī)檢測其凋亡率。

四、檢測細(xì)胞遷移侵襲情況

細(xì)胞劃痕實驗:取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的6孔板中,每孔約2×105個細(xì)胞,以標(biāo)題三中方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后24 h,以200 μL槍頭在每孔底部劃痕,以PBS清洗掉劃痕中的細(xì)胞,在顯微鏡下觀察測量此時劃痕寬度,記為A,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次在顯微鏡下觀察測量此時劃痕寬度,記為B,細(xì)胞遷移率(%)=(A-B)/A×100%。

Transwell小室侵襲實驗:取傳代A549細(xì)胞,以無血清的Ham′s F-12K培養(yǎng)基重懸后接種在經(jīng)基質(zhì)膠包被后的Transwell上室中,每孔約2×105個細(xì)胞,以標(biāo)題三中方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后24 h,在Transwell下室中加入含血清的Ham′s F-12K培養(yǎng)基,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后擦掉上室細(xì)胞,以結(jié)晶紫染色液孵育下室細(xì)胞,然后洗滌、固定,在顯微鏡下觀察計數(shù)著色細(xì)胞,即為細(xì)胞侵襲數(shù)。

五、檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因(Cyclin D1)、凋亡相關(guān)基因(Bax、Caspase-3)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因(E-cadherin、Vimentin)、TROAP基因、Wnt基因及miR-526b-3p表達(dá)

取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的24孔板中,培養(yǎng)24 h后以標(biāo)題三中方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞,以標(biāo)題二中實時熒光PCR實驗方法,檢測其中Cyclin D1、Bax、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin、TROAP、Wnt mRNA及miR-526b-3p表達(dá)。

六、檢測細(xì)胞TROAP、Wnt、增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)

取傳代A549細(xì)胞,接種在一個無菌的24孔板中,培養(yǎng)24 h后以標(biāo)題三中方法分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞,提取出其中總蛋白并測出其濃度后每組取30μg總蛋白,經(jīng)變性、電泳分析、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后,將TROAP、Wnt、Cyclin D1、Bax、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin、β-tubulin、β-actin蛋白自膜上剪下后,孵育相應(yīng)一抗和二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),化學(xué)發(fā)光法顯色后采集各組蛋白圖像,使用Image J軟件分析量化其相對表達(dá)。

七、檢測A549細(xì)胞中miR-526b-3p對TROAP的靶向調(diào)控

將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種在一個無菌的24孔板中,放入37.5℃,5%CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)12 h,然后隨機(jī)分為TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組、TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組、野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組、野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組,各組細(xì)胞以LipofectamineTM2000按照標(biāo)題三中方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染:TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TROAP 3′-UTR無義序列+miR-526b-3p mimic,TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TROAP 3′-UTR無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型TROAP 3′-UTR報告質(zhì)粒+miR-526b-3p mimic,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型TROAP 3′-UTR報告質(zhì)粒+miR-526b-3p mimic陰性對照,突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染突變型TROAP 3′-UTR報告質(zhì)粒+miR-526b-3p mimic,突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染突變型TROAP 3′-UTR報告質(zhì)粒+miR-526b-3p mimic陰性對照,24 h后將各組細(xì)胞消化后收集沉淀,以雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒并參照其說明書指導(dǎo)步驟,檢測各組細(xì)胞的雙熒光素酶相對活性。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、人肺泡上皮細(xì)胞與人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA的表達(dá)

與人肺泡上皮細(xì)胞相比,人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TROAP、Wnt mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各種細(xì)胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA的相對表達(dá)

二、各組A549細(xì)胞增殖、凋亡情況檢測結(jié)果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細(xì)胞核大小不一且產(chǎn)生固縮,并被染為較強(qiáng)的藍(lán)色,呈現(xiàn)凋亡損傷狀態(tài),Edu陽性率顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞與對照組相似,細(xì)胞核較大且形態(tài)圓潤,并被染為微弱的藍(lán)色,Edu陽性率、凋亡率無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞核均變大變圓,藍(lán)色變淺,凋亡損傷得到明顯改善,Edu陽性率均顯著升高(P<0.05),凋亡率顯著降低(P<0.05)(見圖1,2,3,表2)。

圖1 Edu染色檢測A549細(xì)胞增殖(×200)

圖2 Hoechst 33258染色檢測A549細(xì)胞凋亡形態(tài)(×200)

圖3 流式細(xì)胞實驗檢測A549細(xì)胞凋亡注:Annexin V-FITC為熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V;PI為碘化丙啶

表2 各組A549細(xì)胞Edu陽性率、凋亡率

三、各組A549細(xì)胞遷移侵襲情況檢測結(jié)果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)均顯著升高(P<0.05)(見圖4,5,表3)。

圖4 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組A549細(xì)胞遷移情況(×200)

圖5 Transwell侵襲實驗檢測各組A549細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 各組A549細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)

四、各組A549細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin、Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組A549細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)基因相對表達(dá)

五、各組A549細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin、Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(見圖6,表5)。

六、各組細(xì)胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA及蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細(xì)胞miR-526b-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),TROAP、Wnt mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細(xì)胞miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達(dá)組細(xì)胞miR-526b-3p表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),TROAP、Wnt mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+Wnt過表達(dá)組細(xì)胞miR-526b-3p及TROAP mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),Wnt mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見圖7、表6)。

表5 各組A549細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 各組A549細(xì)胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA相對表達(dá)

圖6 免疫印跡檢測各組A549細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

七、A549細(xì)胞中miR-526b-3p對TROAP的靶向調(diào)節(jié)情況

通過Target Scan Human 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-526b-3p與TROAP之間存在結(jié)合位點(見圖8)。與野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組(1.02±0.14)相比,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組(0.26±0.05)相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組(1.01±0.13)、TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組(0.96±0.18)、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組(0.98±0.17)、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組(1.03±0.21)四組之間相對熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。

圖7 免疫印跡檢測各組A549細(xì)胞TROAP、Wnt蛋白表達(dá)

圖8 Target Scan Human 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-526b-3p與TROAP存在之間結(jié)合位點

討 論

隨著醫(yī)療科技的發(fā)展進(jìn)步,免疫治療、靶向治療等新型治療手段逐漸進(jìn)入NSCLC的臨床治療中,但對患者預(yù)后的提升還不夠高,因而深入發(fā)掘NSCLC發(fā)病機(jī)制對其治療手段的改進(jìn)具有重大價值[11-12]。miR-526b-3p是一種抑癌因子,在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),研究顯示,上調(diào)miR-526b-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移侵襲,并誘導(dǎo)其凋亡[13]。miR-526b-3p還可抑制肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性及晚期肺癌轉(zhuǎn)移[14],并減弱NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲活性[5]。本研究結(jié)果顯示,與人肺泡上皮細(xì)胞相比,miR-526b-3p在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中表達(dá)顯著降低,以miR-526b-3p mimic干預(yù)處理A549細(xì)胞,可顯著降低細(xì)胞Edu陽性率、細(xì)胞遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)、細(xì)胞Cyclin D1、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平,上調(diào)細(xì)胞miR-526b-3p表達(dá)、Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平,改善細(xì)胞核固縮、大小不一等凋亡損傷形態(tài),表明過表達(dá)miR-526b-3p可抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá),升高促凋亡基因表達(dá),增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,減弱A549細(xì)胞增殖與侵襲遷移活性,揭示miR-526b-3p可成為治療膠質(zhì)瘤的新靶點。

TROAP在各種腫瘤中具有致癌功效,沉默TROAP表達(dá)可減弱肝細(xì)胞癌的體內(nèi)外增殖活性,阻滯其細(xì)胞周期進(jìn)程,TROAP高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者的生存率較低[15],并可作為肺腺癌患者生存率低的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物[16]。研究顯示TROAP在NSCLC腫瘤發(fā)生過程中表達(dá)逐漸增加[17],敲除NSCLC中TROAP可顯著抑制其癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[7]。Wnt信號可調(diào)控癌細(xì)胞增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,與肺癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān),Wnt/β-Catenin信號通路的失活可顯著抑制NSCLC細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,大大降低其侵襲活性,并誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯和凋亡,阻斷腫瘤的體內(nèi)生長,進(jìn)而延緩NSCLC的進(jìn)展[18-19]。另有研究顯示,Wnt/β-Catenin是TROAP的下游信號,TROAP可通過促進(jìn)Wnt/β-Catenin信號傳導(dǎo)加快膠質(zhì)瘤進(jìn)展[10]。且在Target Scan Human 7.2數(shù)據(jù)庫中查詢到miR-526b-3p與TROAP之間有結(jié)合位點,因此推測通過TROAP基因調(diào)控Wnt信號可能是miR-526b-3p抑制NSCLC細(xì)胞增殖與侵襲遷移的分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,與人肺泡上皮細(xì)胞相比,TROAP、Wnt基因在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中表達(dá)顯著升高,以miR-526b-3p mimic和TROAP過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合、miR-526b-3p mimic和Wnt過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合分別干預(yù)處理A549細(xì)胞,相比miR-526b-3p mimic組,均可明顯減弱過表達(dá)miR-526b-3p對細(xì)胞凋亡的改善作用及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用,最終逆轉(zhuǎn)其對細(xì)胞增殖與侵襲遷移活性的降低功效。通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗可證實在A549細(xì)胞中miR-526b-3p可靶向下調(diào)TROAP的表達(dá),且過表達(dá)TROAP,可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-526b-3p對Wnt基因表達(dá)的抑制作用,表明miR-526b-3p抑制A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、減弱NSCLC增殖與侵襲遷移活性的作用,是通過靶向下調(diào)TROAP的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)Wnt基因表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述,miR-526b-3p可通過靶向下調(diào)TROAP而抑制Wnt信號,進(jìn)而降低細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá),增強(qiáng)促凋亡基因表達(dá),抑制A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,最終減弱NSCLC增殖與侵襲遷移活性。本研究有利于進(jìn)一步深入闡述NSCLC發(fā)生機(jī)制,為NSCLC的臨床分子靶向治療提供了新的見解和策略。