帕利哌酮調(diào)控miR-10a/BDNF通路對(duì)卒中后抑郁大鼠的影響

程 瑤,翟冠楠,劉 強(qiáng),郭延林

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是腦卒中的并發(fā)癥之一[1]。PSD是引起腦卒中病人死亡及自殺率升高的主要并發(fā)癥,嚴(yán)重影響腦卒中病人生命健康[2]。PSD病理機(jī)制復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制未完全闡明。目前,有研究認(rèn)為,腦卒中后神經(jīng)元異常損傷凋亡是引起PSD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因之一[3]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),微小核糖核酸-10a(microRNA-10a,miR-10a)可靶向調(diào)控腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表達(dá),影響海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖及凋亡,從而參與精神分裂癥發(fā)生發(fā)展過程[4],預(yù)示miR-10a/BDNF通路介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡也可能參與PSD發(fā)生發(fā)展過程。帕利哌酮為第二類抗精神病類藥物[5]。有研究發(fā)現(xiàn),帕利哌酮也可促進(jìn)腦卒中后精神障礙病人個(gè)人及社會(huì)功能恢復(fù),且臨床效果較好、不良反應(yīng)少、安全性較高[6]。但帕利哌酮改善腦卒中后精神障礙及PSD的具體生物學(xué)機(jī)制還不甚明確。本研究建立PSD大鼠模型,從miR-10a/BDNF通路方面,對(duì)此進(jìn)行探討,以期闡明帕利哌酮在PSD發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制,并為其開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量220～240 g,購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,符合3R原則,即減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)和替代(replacement)。

1.1.2 主要試劑及儀器 帕利哌酮(貨號(hào):JKLN015804a),購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;尼氏及脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法 (TUNEL)染色試劑盒(貨號(hào):YT8907,CDLG-3559),購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司及武漢純度生物科技有限公司;BDNF、酪氨酸受體激酶B(TrkB)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、凋亡相關(guān)蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗體(貨號(hào):ab108319,ab187041,ab154598,ab184787,購(gòu)自美國(guó)abcam公司);核糖體蛋白S6激酶α(RPS6KA1)抗體(貨號(hào):K23422),購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;RNA提取試劑盒(貨號(hào):TR205-50),購(gòu)自北京天漠科技開發(fā)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):4368814),購(gòu)自武漢極捷生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PSD模型建立及分組、給藥 參照文獻(xiàn)[7]方法取SD大鼠,用線栓法制備中動(dòng)脈栓塞模型,Longa行為學(xué)評(píng)分>1分,視為腦卒中模型造模成功,中動(dòng)脈栓塞術(shù)后7 d,采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激法刺激28 d建立抑郁癥模型,若大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少、目光呆滯現(xiàn)象,隨機(jī)取2只大鼠行尼氏染色,若大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹、核仁消失等現(xiàn)象,視為造模成功,共造模成功50只大鼠,隨機(jī)分為模型組、帕利哌酮組(1.00 mg/kg)、ad-miR-10a組(尾靜脈注射miR-10a過表達(dá)腺病毒,每只100 μL)、ad-NC組(尾靜脈注射不含miR-10a過表達(dá)腺病毒空載體溶液,每只100 μL)、帕利哌酮+ad-miR-10a組,每組10只;另取10只大鼠,不做任何處理,正常喂養(yǎng),作為正常對(duì)照組。

帕利哌酮參照文獻(xiàn)[8]設(shè)置劑量,用0.5%冰醋酸生理鹽水溶液溶解后,灌胃給藥每日1次;ad-miR-10a及ad-NC經(jīng)尾靜脈注射給藥每周2次;帕利哌酮+ad-miR-10a組灌胃給予帕利哌酮的同時(shí),尾靜脈注射ad-miR-10a溶液;模型組及正常對(duì)照組灌胃等量0.5%冰醋酸生理鹽水溶液,各組均給藥4周。

1.2.2 Longa行為學(xué)評(píng)分 末次給藥結(jié)束后12 h,取大鼠,參照文獻(xiàn)[9]方法用Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠行為進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 足失誤比率、曠場(chǎng)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠肢體功能障礙及抑郁樣行為 取大鼠,參照文獻(xiàn)[10]方法記錄大鼠在直徑1.5 mm、邊長(zhǎng)2.5 cm、面積45 cm×30 cm、高2.5 cm的網(wǎng)格平臺(tái)上掉落網(wǎng)格中的次數(shù)(失足次數(shù)),足失誤比率=失足次數(shù)/前肢行走總步數(shù)×100%,以此評(píng)估肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙;參照文獻(xiàn)[11]方法,觀察大鼠在47 cm×47 cm的曠場(chǎng)觀察箱中央?yún)^(qū)的探索活動(dòng)時(shí)間;將大鼠禁食禁水24 h后,置于有1%糖水及等體積清水的實(shí)驗(yàn)箱中,記錄大鼠2 h內(nèi)糖水及清水?dāng)z入量。糖水?dāng)z取百分比=[糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)]×100%。

1.2.4 尼氏染色及TUNEL染色法檢測(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)及凋亡狀況 處死大鼠,冰上解剖取海馬CA1區(qū)組織,分成2部分,一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后切成5 μm切片,取部分切片,脫蠟、水化后,按尼氏及TUNEL染色試劑盒說明書方法染色后,置于顯微鏡下觀察。用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬組織BDNF陽性表達(dá)水平 取1.2.4項(xiàng)中剩余海馬石蠟切片,脫蠟、水化及抗原修復(fù)后,加入一抗抗體(BDNF,1∶500)4 ℃孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶800)室溫孵育2 h,蘇木精復(fù)染后封片,光鏡下觀察拍照,用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)海馬組織TrkB、PI3K、Caspase-3、RPS6KA1蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.4項(xiàng)中海馬冰凍組織,4 ℃解凍后,冰上勻漿提取蛋白,雙辛可寧酸(BCA)法測(cè)蛋白總濃度。取100 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng),加入一抗TrkB、PI3K、Caspase-3、RPS6KA1(1∶100),內(nèi)參β-actin(1∶1 500),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育3 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,化學(xué)發(fā)光成像儀觀察并拍照,以Image J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法檢測(cè)海馬組織miR-10a蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.4中-80 ℃保存的海馬組織,4 ℃解凍后,剪碎、冰上研磨,取勻漿液,按RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法,提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA,以cDNA為模板,行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下:90 ℃、120 s(1個(gè)循環(huán)),95 ℃、 55 s,50～65 ℃、60 s,72 ℃、65 s(45個(gè)循環(huán));用2-△△Ct法計(jì)算miR-10a相對(duì)表達(dá)水平。miR-10a以U6為內(nèi)參。各引物序列由大連寶生物公司合成,引物擴(kuò)增序列為,U6正向引物:ATCGCTTCGGAGCACG,反向引物:CACGCTTCACGAATTTGCGG;miR-10a正向引物:ACCGGTTTTACCCTAAGACCATGGGGAGG,反向引物:TCAACTGTATTTGTGAGGCGTTCGAAGGDGG。

2 結(jié) 果

2.1 帕利哌酮對(duì)大鼠海馬組織miR-10a表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠海馬組織miR-10a表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組相比,帕利哌酮組大鼠海馬組織miR-10a表達(dá)降低(P<0.05),ad-miR-10a組大鼠海馬組織miR-10a表達(dá)升高(P<0.05)。帕利哌酮+ad-miR-10a組可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮組大鼠miR-10a的變化(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬組織miR-10a表達(dá)比較(±s)

2.2 帕利哌酮對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損及肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠Longa行為學(xué)評(píng)分及足失誤比率升高(P<0.05),神經(jīng)功能缺損評(píng)分、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙加重。與模型組相比,帕利哌酮組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙有所減輕,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);ad-miR-10a組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙進(jìn)一步加重(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及足失誤比率比較(±s)

2.3 帕利哌酮對(duì)大鼠抑郁行為的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠中央探索時(shí)間、糖水?dāng)z取百分比降低,抑郁行為嚴(yán)重,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,帕利哌酮組大鼠中央探索時(shí)間、糖水?dāng)z取百分比增加,抑郁行為減輕(P<0.05);ad-miR-10a組中央探索時(shí)間、糖水?dāng)z取百分比減少,抑郁行為進(jìn)一步加重(P<0.05)。帕利哌酮+ad-miR-10a組可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮組大鼠上述指標(biāo)變化(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠中央探索時(shí)間、糖水?dāng)z取百分比比較(±s)

2.4 帕利哌酮對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及凋亡率的影響 尼氏染色顯示,正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元胞核清晰、排列規(guī)則、形態(tài)正常;TUNEL染色顯示,正常對(duì)照組大鼠有少量染成棕紅色的凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠神經(jīng)元腫脹、核固縮、變性、排列紊亂及丟失嚴(yán)重,細(xì)胞凋亡率升高。與模型組相比,帕利哌酮組大鼠神經(jīng)元變性損傷減輕,細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);ad-miR-10a組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞變性損傷進(jìn)一步加重,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)。帕利哌酮+ad-miR-10a組可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮組大鼠上述指標(biāo)變化(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞尼氏及TUNEL染色圖(×400)

表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位:%

2.5 帕利哌酮對(duì)大鼠海馬組織BDNF陽性表達(dá)的影響 免疫組化顯示,BDNF在正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠海馬神經(jīng)元BDNF陽性表達(dá)減弱(P<0.05)。與模型組相比,帕利哌酮組大鼠海馬神經(jīng)元BDNF陽性表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);ad-miR-10a組大鼠海馬神經(jīng)元BDNF陽性表達(dá)進(jìn)一步減弱(P<0.05)。帕利哌酮+ad-miR-10a組可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮組上述指標(biāo)變化(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 大鼠海馬組織BDNF免疫組化染色圖(×400)

表5 各組大鼠海馬組織BDNF陽性表達(dá)水平比較(±s) 單位:平均光密度/mm2

2.6 帕利哌酮對(duì)大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較,帕利哌酮組大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1蛋白表達(dá)升高(P<0.05),Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05);ad-miR-10a組大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)。帕利哌酮+ad-miR-10a組可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮組上述指標(biāo)變化(P<0.05)。詳見圖3、表6。

圖3 大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1、Caspase-3蛋白表達(dá)條帶圖

表6 各組大鼠海馬組織TrkB、PI3K、RPS6KA1、Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

據(jù)流行病學(xué)分析,約85%的腦卒中病人罹患PSD,預(yù)計(jì)到2030年,PSD將成為人類健康的主要?dú)⑹种籟12]。腦卒中后,海馬神經(jīng)元損傷凋亡,可引發(fā)PSD病人軀體功能障礙及生活上的不便,繼而引發(fā)情緒上的改變,導(dǎo)致情緒低落、反應(yīng)遲鈍、興趣減退、淡漠等抑郁樣行為的產(chǎn)生[13]。而持續(xù)的抑郁也會(huì)引起海馬神經(jīng)元損傷及凋亡[14],加重PSD病理癥狀。本研究建立PSD大鼠模型后,發(fā)現(xiàn)大鼠行走時(shí)轉(zhuǎn)圈、跛行、運(yùn)動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、形體消瘦等現(xiàn)象嚴(yán)重,且行為學(xué)評(píng)分、足失誤比率高,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能缺損、肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙、空間探索興趣減退及快感缺乏嚴(yán)重,光鏡檢測(cè)可見大鼠海馬神經(jīng)元腫脹、變形等損傷及凋亡率升高,提示大鼠出現(xiàn)肢體功能障礙及海馬神經(jīng)元損傷、凋亡現(xiàn)象,表明造模成功。

抗抑郁及精神藥物治療,緩解抑郁癥狀,是PSD的主要治療方式之一[15]。帕利哌酮為第二類抗精神藥物,多用于難治性精神分裂癥的治療[16]。李珂等[17]研究發(fā)現(xiàn)帕利哌酮也可用于因腦外傷所致的精神類疾病的治療。PSD屬于腦血流供應(yīng)不足性腦損傷引起的一系列精神類疾病[18],提示帕利哌酮也可能成為緩解PSD抑郁癥狀的潛在藥物。本研究結(jié)果顯示,帕利哌酮組大鼠抑郁行為明顯緩解,海馬神經(jīng)元損傷及凋亡也得到明顯改善,證實(shí)帕利哌酮具有較好的緩解PSD抑郁癥狀的作用。但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

BDNF是神經(jīng)元細(xì)胞存活及生長(zhǎng)的主要調(diào)控因子,又是重要的抗抑郁基因[19]。Han等[20]研究發(fā)現(xiàn)BDNF降低或缺失,可能是引起神經(jīng)凋亡、萎縮,進(jìn)而導(dǎo)致抑郁發(fā)生的重要調(diào)控因子之一。Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn),BDNF可與TrkB結(jié)合,激活PI3K等傳導(dǎo)通路,以調(diào)節(jié)腦缺血后抗應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活,抵抗腦卒中后神經(jīng)元凋亡及PSD抑郁癥狀的發(fā)生。另外,BDNF也可通過激活RPS6KA1表達(dá),介導(dǎo)特定前凋亡蛋白如Caspase-3的失活、啟動(dòng)抗凋亡蛋白合成等抑制細(xì)胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn),BDNF在PSD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中表達(dá)降低的同時(shí),其下游通路TrkB、PI3K、RPS6KA1等蛋白表達(dá)也明顯降低,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)異常升高,證實(shí)BDNF介導(dǎo)的相關(guān)通路蛋白降低,可能參與PSD神經(jīng)元凋亡及抑郁癥狀的發(fā)生過程。miRNA在PSD發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)PSD病人血清中約有25種差異表達(dá)的miRNA參與調(diào)控PSD過程。易善志等[4]發(fā)現(xiàn)miR-10a在精神分裂癥病人海馬神經(jīng)元細(xì)胞中異常高表達(dá),且高表達(dá)的miR-10a可通過靶向抑制BDNF表達(dá),來促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡,參與調(diào)控精神障礙類疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究模型組大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)降低,miR-10a表達(dá)升高,進(jìn)一步上調(diào)miR-10a表達(dá)后,大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)進(jìn)一步降低,BDNF下游相關(guān)通路TrkB、PI3K、RPS6KA1等蛋白表達(dá)也進(jìn)一步降低,大鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的抑郁癥狀及海馬神經(jīng)元損傷凋亡現(xiàn)象,提示miR-10a上調(diào),可能是導(dǎo)致BDNF降低,PSD大鼠海馬神經(jīng)元損傷、凋亡加重及抑郁樣行為進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。帕利哌酮組大鼠海馬組織中表現(xiàn)出miR-10a下調(diào),BDNF及其下游通路TrkB、PI3K、RPS6KA1等蛋白表達(dá)的上調(diào),提示帕利哌酮抑制PSD大鼠海馬神經(jīng)元損傷、凋亡,發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制可能與下調(diào)miR-10a表達(dá),上調(diào)BDNF及其下游通路TrkB、PI3K、RPS6KA1等蛋白表達(dá)有關(guān)。上調(diào)miR-10a可逆轉(zhuǎn)帕利哌酮的上述作用。

綜上所述,帕利哌酮可能通過下調(diào)miR-10a表達(dá),激活BDNF通路,抑制PSD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷、凋亡發(fā)揮抗抑郁作用。為帕利哌酮發(fā)揮抗抑郁作用的基因靶向調(diào)控機(jī)制提供一定參考。但腦卒中后海馬神經(jīng)元損傷、凋亡及抑郁癥狀發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)RNA、多條通路、多種細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié),帕利哌酮緩解PSD抑郁癥狀的其他可能機(jī)制,還有待后續(xù)深入研究。

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