非編碼RNA與先天性心臟病合并肺動(dòng)脈高壓關(guān)系的研究進(jìn)展

曹 策,郭光偉,李 強(qiáng),楊少俊

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是一類常見的嬰幼兒缺陷疾病,受到遺傳、環(huán)境及母體健康等多因素的影響,表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,每年有超過150萬的活嬰伴有不同程度的先天性心臟病,從房間隔缺損、室間隔缺損到復(fù)雜的法洛四聯(lián)癥(TOF)、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位等,同時(shí)我國先天性心臟病發(fā)病率也在逐年攀升,圍生期總發(fā)病率可達(dá)2.9%,以室間隔缺損和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉最為常見[1]。作為先天性心臟病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)的診斷標(biāo)準(zhǔn)是在平靜狀態(tài)下通過右心導(dǎo)管測得平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)≥25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),肺動(dòng)脈楔壓(PAWP)≤15 mmHg和肺動(dòng)脈阻力(PAV)>3 WU/m2[2]。目前先天性心臟病合并肺動(dòng)脈高壓(CHD-PAH)的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,主要病變部位存在于肺小動(dòng)脈,考慮可能與內(nèi)皮細(xì)胞受損、長期慢性炎癥、平滑肌細(xì)胞增厚、肺血管重建和原位血栓相關(guān)[3]。在疾病進(jìn)展過程中,由于大量血液異常分流,肺動(dòng)脈壓力升高和阻力持續(xù)增加,導(dǎo)致先天性心臟病常伴有肺動(dòng)脈高壓,隨著壓力不可逆地升高還會(huì)出現(xiàn)右向左分流,即艾森曼格綜合征(Eisenmenger syndrome,ES),治療效果差,預(yù)后常常不佳,早期診斷和及時(shí)干預(yù)顯得尤其重要[4]。

目前國內(nèi)外用于CHD-PAH的診斷方法主要有經(jīng)右心導(dǎo)管測壓(right heart catheterization,RHC)、超聲心動(dòng)圖(ultrasonic cardiogram,UCG)及心臟磁共振技術(shù)(magnetic resonance imaging,MRI)。UCG是一項(xiàng)評(píng)估先天性心臟病病人病情發(fā)展的基礎(chǔ)工具,主要適用于心臟結(jié)構(gòu)異常,但對(duì)于心臟血流動(dòng)力學(xué)定量評(píng)估不夠精準(zhǔn)[5]。MRI技術(shù)作為一項(xiàng)新的補(bǔ)充檢測技術(shù),近年來在臨床推廣使用,通過提高時(shí)間和空間分辨率更加直觀地檢測肺血管軸徑,對(duì)PAH有一定預(yù)測能力。UCG和MRI最終都需要RHC確定結(jié)果。RHC是診斷PAH的金標(biāo)準(zhǔn),但屬于有創(chuàng)操作,缺乏經(jīng)驗(yàn)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥,不易多次重復(fù)進(jìn)行。隨著RNA測序技術(shù)的產(chǎn)生和快速發(fā)展,非編碼RNA(ncRNA)作為一類不參與基因轉(zhuǎn)錄的特殊RNA,逐漸成為心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其中微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(LcnRNA)和環(huán)狀RNA(cricRNA)都被證實(shí)與先天性心臟病、冠心病及高血壓相關(guān)[6]?，F(xiàn)就非編碼RNA與CHD-PAH關(guān)系的研究進(jìn)展綜述如下。

1 miRNA與CHD-PAH的關(guān)系

1.1 miRNA概述 miRNA是一種核苷酸數(shù)目介于18～25的內(nèi)源性雙鏈非編碼RNA,幾乎存在于各種類型細(xì)胞中,參與心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和癌癥等多種疾病的調(diào)控。miRNA由RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo),在DNA非編碼區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,生成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的原始miRNA(pri-RNA),經(jīng)由Drosha和DGCR8復(fù)合體剪接為前體miRNA(pre-miRNA), 被Expotin5蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中,被Dicer酶處理成為成熟miRNA。根據(jù)互補(bǔ)配對(duì)原則與mRNA的3′或5′非編碼區(qū)結(jié)合,通過簡單切斷mRNA或抑制mRNA翻譯,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)和調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯[7]。

1.2 miRNA對(duì)CHD-PAH的影響 現(xiàn)有研究表明,miRNA的異常表達(dá)與CHD-PAH有密切的聯(lián)系, Chen等[8]運(yùn)用微陣列測序法分析了14例室間隔缺損合并重度PAH的病人和16例單純室間隔缺損病人miRNA表達(dá)譜的差異,并用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)78個(gè)miRNA出現(xiàn)變化,其中miR-19a、miR-130a和miR-27b出現(xiàn)雙倍程度變化;miR-19a曲線下面積最大,miR-19a有望作為 CHD-PAH的新型生物標(biāo)志物。miR-130a作為一種內(nèi)皮細(xì)胞表型表達(dá)的調(diào)節(jié)器,抑制同源基因GAX表達(dá),刺激血管生長因子發(fā)揮作用;miR-147可以預(yù)防長期炎癥反應(yīng),Toll樣受體4(TLR4)是一種能被炎性細(xì)胞識(shí)別入侵的微生物病原體,可以增加miR-147的表達(dá)水平,當(dāng)miR-147敲除時(shí)炎性細(xì)胞因子表達(dá)相應(yīng)增加。此外,郭建洲等[9]運(yùn)用PCR技術(shù)檢測80例病人血漿中miRNA表達(dá)譜的變化,且發(fā)現(xiàn)輕度、中度PAH病人miR-18a、miR-27b、miR-130a表達(dá)顯著上調(diào)及miR-204表達(dá)顯著下調(diào),miR-18a和miR-130a參與血管平滑肌細(xì)胞增殖過程,miR-204通過調(diào)控SHP2基因表達(dá)影響肺臟血管舒張和收縮因子的比例調(diào)控,表明在CHD-PAH疾病早期miRNA起一定調(diào)控作用,此時(shí)積極干預(yù)可達(dá)到預(yù)防效果。 miR-23a位于染色體19p13.12上,作為miR-23a/24/27a家族的一員,已被多位學(xué)者證實(shí)在PAH發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。Zhang等[10]研究表明,miR-23a在成年CHD-PAH病人中表達(dá)上調(diào),且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-23a可靶向調(diào)控骨形態(tài)蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2),該通路已被證實(shí)與PAH的發(fā)生相關(guān),在miR-23a敲除條件下可消除與BMPR2的相互作用,抑制缺氧期間平滑肌細(xì)胞的增殖,后期可嘗試通過恢復(fù)BMPR2的表達(dá)水平來預(yù)防PAH。徐珊珊等[11]發(fā)現(xiàn)在CHD-PAH病人中miR-34a聯(lián)合UCG診斷價(jià)值高于單一方式診斷,特異度和靈敏度均達(dá)到85%以上,同時(shí)miR-34a調(diào)控血小板衍生因子α受體來促進(jìn)肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖和減少凋亡,達(dá)到調(diào)節(jié)血管收縮和肺血管重建的目的[12]。Chang等[13]通過主動(dòng)脈-靜脈瘺大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21在PAH早期表達(dá)呈上調(diào)趨勢,晚期表達(dá)呈下調(diào)趨勢,早期miR-21上調(diào)可能與右室心肌細(xì)胞相關(guān),蛋白激酶B(AKT)和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)心肌肥厚相關(guān)蛋白相應(yīng)增加,出現(xiàn)代償性右室肥厚,維持右室細(xì)胞功能,一旦進(jìn)入晚期失代償階段,miR-21表達(dá)下調(diào)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3等相關(guān)凋亡蛋白增加,提示出現(xiàn)右心衰竭,miR-21也有可能成為有效的新型生物標(biāo)志物。miR-204被認(rèn)為與肺動(dòng)脈壓力呈負(fù)相關(guān),通過調(diào)控平滑肌細(xì)胞中活化T細(xì)胞核因子(NFAT)和缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)家族影響肺遠(yuǎn)端血管重建。miR-451與缺血再灌注和心肺損傷相關(guān),通過增加肺內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,抑制血管的生成,對(duì)合并PAH病人起代償和保護(hù)的作用。Ji等[14]研究在61例CHD-PAH患兒、53例冠心病病人以及60名健康對(duì)照者中發(fā)現(xiàn)CHD-PAH患兒外周血miR-204和miR-451表達(dá)水平明顯下降,且運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定腦利鈉肽(BNP)和非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-204、miR-451和BNP、ADMA有高度相關(guān)性,聯(lián)合檢測miR-204和miR-451的表達(dá)具有較高診斷價(jià)值。miRNA作為CHD-PAH的生物標(biāo)志物已成為新的研究方向,未來的研究將尋找更多具有診斷價(jià)值的miRNA。

2 cricRNA與CHD-PAH的關(guān)系

2.1 cricRNA概述 cricRNA是一種由pre-mRNA反向剪接生成的特殊ncRNA,與線性RNA不同,其具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu),不存在5′-帽端或3′-聚腺苷酸尾端,穩(wěn)定性強(qiáng),不易受到外切酶影響[15]。之前被認(rèn)為是惰性的剪接副產(chǎn)物,現(xiàn)有的研究表明其廣泛存在于真核細(xì)胞之中,在不同組織中呈明顯差異化表達(dá),主要通過以下4種生物學(xué)過程參與基因調(diào)控:①cricRNA可以充當(dāng)“海綿”,與內(nèi)源性RNA(ceRNA)相互競爭,吸附miRNA發(fā)揮作用,上調(diào)目標(biāo)靶基因的表達(dá)。比如TOF是一種常見的紫紺型先天性心臟病,Kan等[16]通過建立cricRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選出BCL2L11、磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)、抑瘤素M受體(OSMR)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、人runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)和白細(xì)胞介素-6受體(IL6R)7個(gè)關(guān)鍵中樞基因。同時(shí)驗(yàn)證hsa-cric-000601/hsa-miR-148a/BCL2L11作為關(guān)鍵的信號(hào)通路調(diào)控軸,為下一步了解TOF發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供新方案。②cricRNA與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中起作用。③部分cricRNA可以作為翻譯模板直接翻譯出短肽[17]。④外顯子-內(nèi)含子cricRNA與U1小核核糖核蛋白互相作用,以及RNA聚合酶Ⅱ共同促進(jìn)親代基因的轉(zhuǎn)錄[18]。cricRNA與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、心腦血管疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。

2.2 cricRNA對(duì)CHD-PAH的影響 ncRNA對(duì)于闡明CHD-PAH的病因提供越來越多的證據(jù)支持。潘秋亞等[19]通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),冠心病患兒血清有375個(gè)變化cricRNA,其中,有115個(gè)上調(diào)和260個(gè)下調(diào)的circRNA,并預(yù)測每個(gè)差異表達(dá)circRNA的靶基因miRNA,作用機(jī)制可能與局灶性粘連和血管平滑肌收縮有關(guān),同時(shí)提出circRNA可與多個(gè)miRNA結(jié)合作用,例如hsa-cric-102410有5個(gè)與miRNA結(jié)合位點(diǎn),吸附靶標(biāo)miR-92a-1-5p、miR-92b-5p、miR-612、miR-181d-3p和miR-890,miRNA也會(huì)有一個(gè)或多個(gè)與cricRNA結(jié)合位點(diǎn),互相作用參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,共同調(diào)控心臟的發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn),cricRNA hsa-cric-0029642和CHD-PAH有一定的關(guān)聯(lián)[20]。在20例成年CHD-PAH病人血清中hsa-cric-0029642表達(dá)量明顯低于不伴PAH的病人;由此得出hsa-cric-0029642與PAH密切相關(guān),一方面可能是由于先天性心臟病病人血流動(dòng)力學(xué)的改變和長期持續(xù)炎癥作用使調(diào)控RNA編輯酶1(ADAR1)升高,與之呈負(fù)相關(guān)的cricRNA表達(dá)量下降,從而作用于平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化;另一方面13號(hào)染色體上抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝增殖的CRYL1基因受損,共同促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化和肺遠(yuǎn)端小血管結(jié)構(gòu)重建。Wang等[21]運(yùn)用微陣列分析法在缺氧誘導(dǎo)PAH小鼠中發(fā)現(xiàn),有23個(gè)顯著上調(diào)的circRNA和41個(gè)顯著下調(diào)的circRNA,其中hsa-cric-004592和 hsa-cric-018351最有希望成為新型診斷生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn),基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析顯示,失調(diào)的cricRNA在缺氧誘導(dǎo)的PAH發(fā)病過程中起主要作用,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖,同時(shí)一氧化氮(NO)含量下降,進(jìn)一步促進(jìn)肺動(dòng)脈壓力和阻力升高。環(huán)狀RNA是缺氧誘發(fā)PAH的關(guān)鍵調(diào)控因子,有望作為PAH早期臨床診斷的生物標(biāo)志物,對(duì)靶向治療有一定的輔助作用。

越來越多的分子生物學(xué)研究表明cricRNA參與先天性心臟病相關(guān)PAH的發(fā)展過程。Su等[22]實(shí)驗(yàn)分析了8例CHD-PAH患兒的circRNA差異表達(dá)水平,并用PCR技術(shù)對(duì)5個(gè)明顯變化cricRNA進(jìn)行驗(yàn)證,運(yùn)用miRanda and TargetScan軟件預(yù)測circRNA靶向基因,最終發(fā)現(xiàn)兩種顯著變化circRNA(hsa-circ-0003416和005372)通過作用氧化磷酸化和緊密連接信號(hào)通路影響肺平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡,進(jìn)而引起PAH的發(fā)生。同時(shí)有研究運(yùn)用PCR技術(shù)在50例CHD-PAH病人和20名健康受試者血漿中檢測hsa-circ-0003416表達(dá)水平并分析其與一般臨床資料的關(guān)系,采用受試者工作特征(ROC)曲線確定此circRNA的診斷性能,表明BNP是心室肌細(xì)胞感知壓力升高時(shí)分泌的一種肽類激素,CHD-PAH組BNP水平高于其他組,與hsa-circ-0003416表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了研究結(jié)果的可靠性[23]。此外,hsa-circ-0003416可激活PI3K/AKT和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)靶向調(diào)控信號(hào)通路,并且這兩條通路都已證實(shí)與PAH發(fā)生相關(guān)。

3 小結(jié)與展望

隨著生物測序技術(shù)的不斷發(fā)展,人們對(duì)非編碼RNA在心臟平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí),miRNA和cricRNA作為具有潛力的生物學(xué)標(biāo)志物,有助于更好地及早診斷出CHD-PAH,為病人爭取更多手術(shù)機(jī)會(huì),在干預(yù)治療上

提供新的靶點(diǎn),為下一步逆轉(zhuǎn)或減輕PAH提供可能。

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