檸檬酸鹽對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及LKB1/AMPK信號通路的影響

張 博,周學(xué)才,朱冬梅,萬 翔

心肌損傷(myocardial injury,MI)普遍認(rèn)可的定義為超聲心動圖和心電圖出現(xiàn)異常或者心肌肌鈣蛋白過高[1]。高血脂、高血壓可以導(dǎo)致心肌缺血引發(fā)心肌梗死,通過介入手術(shù)或者藥物溶栓可以實(shí)現(xiàn)缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R),但此時可以引發(fā)心肌損傷[2],其對病人生命健康有巨大威脅,且是病人死亡的獨(dú)立因子[3]。探尋可以保護(hù)心肌細(xì)胞的藥物具有重大意義。線粒體中谷氨酰胺代謝通路可以合成檸檬酸鹽,其可以通過螯合血液內(nèi)鈣離子實(shí)現(xiàn)抗凝血的作用,同時可以抑制炎性因子[4],降低腎I/R損傷指標(biāo)水平,明顯提高腎I/R及炎性細(xì)胞因子從而影響的細(xì)胞活力[5]。5′-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′-AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種代謝的中心調(diào)控因子,在細(xì)胞自噬與細(xì)胞極化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生減少時,AMPK被磷酸化而激活[6],激活A(yù)MPK信號通路可以降低線粒體超氧化物的含量,調(diào)節(jié)心肌收縮能力,降低I/R引起的心肌梗死[7],肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)不僅是絲氨酸/蘇氨酸激酶,也是代謝調(diào)控因子,具有調(diào)控炎癥的作用[8]。激活LKB1/AMPK信號通路恢復(fù)腸道自噬,可改善腸道I/R損傷[9]。因此,本研究觀察不同濃度檸檬酸鹽對缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞損傷及LKB1/AMPK信號通路的影響,探究保護(hù)心肌細(xì)胞的分子機(jī)制,為防止心肌細(xì)胞損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人心肌細(xì)胞(HCM),貨號:CP-H076,購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 青霉素鈉(Penicillin G Sodium)、AMPK抑制劑(Doxorubicin HCI,貨號:S416001、S1208)購于上海藍(lán)木化工有限公司;鏈霉素(貨號:A103-01)購于翌圣生物科技(上海)股份有限公司;DMEM basic(1X)高糖培養(yǎng)液(貨號:C11995500BT)購于廣州賽國生物科技有限公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基(貨號:12633012)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)消化液、總RNA提取試劑盒、通用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(M-MLV,貨號:T1300、R1200、RP1100)購于北京索萊寶科技有限公司;Korser檸檬酸鹽(貨號:GR1962)購于上海廣銳生物科技有限公司;細(xì)胞增殖毒性檢測(CCK-8)試劑盒(貨號:GK10001)購于上海宏葉生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1062S)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;LKB1、AMPK、磷酸化LKB1(p-LKB1)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、Bcl-2、Bax、羊抗兔IgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號:ab138386、ab32047、ab63473、ab92701、ab321124、ab32503、ab150077、ab8245)購于美國Abcam公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號:LW-80A-Ⅲ)購于上海利聞科學(xué)儀器有限公司;倒置顯微鏡(型號:CM2000S)購于睿鴻光電科技(福建)有限公司;全功能定量PCR儀(型號:QuantStudio12Flex)購于上海土森視覺科技有限公司;細(xì)胞計數(shù)器(型號:ADAM-MC2)購于艾萬拓威達(dá)優(yōu)爾國際貿(mào)易(上海)有限公司;酶標(biāo)儀(型號:SAF-680T)購于上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;流式細(xì)胞儀(型號:130-109-803)購于德國美天旎生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HCM培養(yǎng)及H/R損傷細(xì)胞模型制備 取HCM細(xì)胞株,培養(yǎng)于含有10×105U/L青霉素鈉、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件設(shè)置為:95%空氣,5%CO2,37 ℃,每2 d更換1次培養(yǎng)液,HCM細(xì)胞呈同步搏動時,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。缺氧處理過程:HCM細(xì)胞使用無糖DMEM洗滌3次,使用無糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件設(shè)置為:95%N2,5%CO2,37 ℃,培養(yǎng)2.5 h;復(fù)氧處理過程:將缺氧處理過的HCM細(xì)胞使用含糖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件設(shè)置為:95%空氣,5%CO2,37 ℃,培養(yǎng)2 h后進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HCM細(xì)胞分組及檸檬酸鹽處理 取對數(shù)生長期HCM細(xì)胞,使用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化,重懸HCM細(xì)胞并隨機(jī)分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))、H/R組、檸檬酸鹽低劑量組(20 μmol/mL檸檬酸鹽培養(yǎng)液)、檸檬酸鹽中劑量組(40 μmol/mL檸檬酸鹽培養(yǎng)液)、檸檬酸鹽高劑量組(80 μmol/mL檸檬酸鹽培養(yǎng)液)、檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組(3 mg/kg LKB1/AMPK通路抑制劑Doxorubicin HCI、80 μmol/mL檸檬酸鹽培養(yǎng)液)[10],檸檬酸鹽低、中、高劑量組及通路抑制劑組在建模后30 min進(jìn)行給藥處理。

1.3.3 CCK-8法檢測HCM細(xì)胞增殖能力 取經(jīng)H/R處理的HCM細(xì)胞,將重懸后的HCM細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105個/mL的細(xì)胞懸浮液,以每孔0.5 mL接種于24孔培養(yǎng)板,每組3個復(fù)孔,每孔加入10 μL濃度為10%的CCK-8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集HCM細(xì)胞,通過酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光值(OA),細(xì)胞增殖抑制率(%)=(藥物組OA值/正常組OA值)×100%。

1.3.4 生化法檢測HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物水平 取HCM細(xì)胞培養(yǎng)液,3 500 r/min離心10 min,去上清液,完全按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,利用生化分析儀檢測培養(yǎng)基中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測HCM細(xì)胞凋亡水平 取H/R處理的HCM細(xì)胞,完全按照Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書進(jìn)行測定,用胰蛋白酶消化各組HCM細(xì)胞,將重懸后的HCM細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL,加入70%乙醇溶液在4 ℃環(huán)境中固定過夜,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后離心去除上清液,將細(xì)胞重懸后加入5 μL Annexin V-FITC(標(biāo)記細(xì)胞)、2 μL RNA酶(去除內(nèi)源性RNA)、2 μL PI溶液,室溫下孵育35 min后使用細(xì)胞流式儀檢測HCM細(xì)胞凋亡情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Bloting)檢測HCM細(xì)胞凋亡、LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取H/R處理的HCM細(xì)胞,采用Western Bloting法檢測各組HCM細(xì)胞凋亡相關(guān)因子(Bax、Bcl-2)、LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。獲取各組HCM細(xì)胞,重懸HCM細(xì)胞并將濃度調(diào)整為2×106個/mL接種于24孔培養(yǎng)板中,低溫下加入RIPA蛋白裂解液裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心30 min,取上清至無菌離心管中,按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒的說明書進(jìn)行操作,測定其中蛋白質(zhì)含量,取40 μg蛋白使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉溶液封閉1 h,4 ℃下添加Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK兔源一抗與GAPDH(1∶500)4 ℃孵育過夜,用TBST洗滌后添加羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫下孵育4 h。采用蛋白成像凝膠儀對凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2)、LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白水平進(jìn)行半定量分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組HCM細(xì)胞增殖能力比較 與對照組相比,H/R組HCM細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05);與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞增殖抑制率明顯降低(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽劑量的升高,HCM細(xì)胞增殖抑制率降低;與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組HCM細(xì)胞增殖能力比較(±s) 單位:%

2.2 各組HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物水平比較 與對照組相比,H/R組HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物CK-MB、LDH水平明顯升高(P<0.05);與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物CK-MB、LDH水平明顯降低(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽濃度的升高,HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物CK-MB、LDH水平隨之降低;與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物CK-MB、LDH水平明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組HCM細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷生化標(biāo)志物水平比較(±s)

2.3 各組HCM細(xì)胞凋亡率比較 與對照組相比,H/R組HCM細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽濃度的升高,HCM細(xì)胞凋亡率隨之降低;與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。詳見表3、圖1。

圖1 各組HCM細(xì)胞凋亡流式圖

表3 各組HCM細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位:%

2.4 各組HCM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平比較 與對照組相比,H/R組HCM細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽濃度的升高HCM細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽濃度的升高HCM細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高;與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4、圖2。

圖2 各組HCM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組HCM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平比較(±s)

2.5 各組HCM細(xì)胞中LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比,H/R組HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),且隨著檸檬酸鹽濃度的升高HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平升高;與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表5、圖3。

圖3 LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

表5 各組HCM細(xì)胞中LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

心肌損傷是由于心臟I/R造成,長期I/R損傷可能引發(fā)DNA損傷、細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡,可導(dǎo)致急性冠脈綜合征和心肌梗死[11],嚴(yán)重威脅病人的生命健康。檸檬酸鹽是一種重要代謝產(chǎn)物,不僅可以作為膽固醇與細(xì)胞質(zhì)合成脂肪酸的碳源,還可以促進(jìn)線粒體能量代謝,使用其預(yù)處理可以有效降低心肌細(xì)胞凋亡[12]。檸檬酸鹽具有抑制新鮮血液凝固的作用,在臨床采血中被用作抗凝血劑,并有報道指出其可以起保護(hù)心肌的作用,有效抑制心肌細(xì)胞凋亡[13]。心肌細(xì)胞受到損傷時生化標(biāo)志物CK-MB、LDH就會由心肌細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到心肌細(xì)胞外[14],因此,CK-MB、LDH的含量可以很好地反映心肌損傷的受損程度,CK-MB、LDH釋放量減少時則心肌細(xì)胞損傷程度明顯降低[15]。因此,本實(shí)驗(yàn)以人心肌細(xì)胞HCM為研究對象,利用H/R誘發(fā)心肌損傷,探究檸檬酸鹽對心肌細(xì)胞損傷及LKB1/AMPK信號通路的影響。本研究使用N2環(huán)境處理HCM細(xì)胞2.5 h,之后恢復(fù)O2環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)2 h制作H/R模型即H/R組,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常培養(yǎng)的HCM細(xì)胞相比,H/R組HCM細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及CK-MB、LDH蛋白表達(dá)水平明顯升高,表明H/R模型制作符合實(shí)驗(yàn)要求。Bax與Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中特異性表達(dá),其表達(dá)水平可以反映細(xì)胞凋亡程度[16]。與H/R組相比,檸檬酸鹽低、中、高劑量組HCM細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及CK-MB、LDH、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,表明檸檬酸鹽可以保護(hù)心肌損傷,并且隨著檸檬酸鹽劑量的升高,其保護(hù)作用越強(qiáng)。

LKB1/AMPK信號通路的激活可以增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力[17]。LKB1是AMPK的上游激酶,可以激活A(yù)MPK[18]。激活的AMPK是關(guān)鍵的能量傳感器,維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài),可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝發(fā)揮作用的[19],激活LKB1/AMPK信號通路可以通過影響能量代謝調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[20],同時,有研究報道,加強(qiáng)激活LKB1/AMPK信號通路可以明顯改善壞死與凋亡,保護(hù)受損的心肌細(xì)胞[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與H/R組相比,檸檬酸鹽高劑量組HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高,表明檸檬酸鹽可促進(jìn)HCM細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,保護(hù)受損的HCM細(xì)胞,可能與激活LKB1/AMPK信號通路有關(guān);與檸檬酸鹽高劑量組相比,檸檬酸鹽高劑量+抑制劑組HCM細(xì)胞中p-LKB1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低,進(jìn)一步證明檸檬酸鹽促進(jìn)受損的HCM細(xì)胞生存是通過激活LKB1/AMPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,檸檬酸鹽可以促進(jìn)受損的HCM細(xì)胞生存,可能與激活LKB1/AMPK信號通路有關(guān),但影響受損的HCM細(xì)胞生存因素較多,細(xì)胞內(nèi)信號通路具有多種功能,因此,避免心肌細(xì)胞H/R損傷仍需深入研究。

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