《傷寒論》方治療糖尿病腎病的數(shù)據(jù)挖掘及核心藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

吳偉,樊啟輝,黃艷麗

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330000

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一[1-2],其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[3],終末期會導(dǎo)致腎功能衰竭。張仲景《傷寒論》以六經(jīng)鈐百病[4],有關(guān)《傷寒論》方治療糖尿病腎病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究較多,但尚無此類研究的數(shù)據(jù)挖掘報(bào)道。筆者通過數(shù)據(jù)挖掘,總結(jié)糖尿病腎病的六經(jīng)辨證特點(diǎn),藥物運(yùn)用規(guī)律,發(fā)現(xiàn)核心藥物;結(jié)合核心藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,推測疾病的發(fā)病規(guī)律,為糖尿病腎病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源選取中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(中國知網(wǎng))、萬方數(shù)據(jù)庫、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(維普),中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)、英文數(shù)據(jù)庫Pubmed中關(guān)于《傷寒論》方治療糖尿病腎病的文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入《傷寒論》單方、合方治療糖尿病腎病的臨床研究、動物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn);排除一般性綜述、循證研究、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究、其他聯(lián)合用藥研究及雷同文獻(xiàn)。

1.3 資料檢索與收集兩名研究者以《傷寒論》112首方劑“方名”如“桂枝湯”或“六經(jīng)”“經(jīng)方”“傷寒論”和“糖尿病腎病”為檢索詞檢索中文數(shù)據(jù)庫,以英文方名如“Guizhi Decoction”和“diabetic nephropathy”為檢索詞檢索英文數(shù)據(jù)庫,檢索時(shí)間均為建庫至2021年12月31日。剔除不符合要求文獻(xiàn),制作Excel表,橫目錄標(biāo)題為臨床研究、動物實(shí)驗(yàn)研究,縱目錄標(biāo)題為112首方劑方名和合方名。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法數(shù)據(jù)采用Excel表、SPSS 24.0、SPSS Modeler 18.0、云圖匯等工具進(jìn)行分析。累積條圖呈現(xiàn)各方劑研究頻數(shù)及類型分布;?；鶊D展示所納入方劑在六經(jīng)病的分布比例;熱力圖發(fā)現(xiàn)核心應(yīng)用的藥物;太陽輻射圖分析藥物的四氣五味、歸經(jīng)特征;關(guān)聯(lián)規(guī)則分析藥物間的關(guān)聯(lián)度;聚類分析觀察藥物間的聚集模式;環(huán)形圖呈現(xiàn)方劑對應(yīng)原文證候分布;關(guān)系圖展示藥物與證候間的聯(lián)系;堆疊玉玨圖發(fā)現(xiàn)納入方劑的療效;云雨圖發(fā)現(xiàn)藥物的劑量規(guī)律。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、Genecards等數(shù)據(jù)庫篩選活性成分及疾病靶點(diǎn),運(yùn)用Cytoscape 3.9.0軟件繪制互作圖發(fā)現(xiàn)疾病-成分-靶點(diǎn)關(guān)系,Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析探討其作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果及特征初步檢索中文文獻(xiàn)387篇,英文文獻(xiàn)2篇,逐一篩選,最終納入17篇文獻(xiàn),均為中文,其中動物實(shí)驗(yàn)研究5篇[5-9],臨床研究12篇[10-21]。所用方劑有大黃黃連瀉心湯、五苓散、真武湯、抵當(dāng)湯、葛根芩連湯、五苓散合四逆湯、小柴胡湯、小陷胸湯、芍藥甘草湯、苓桂術(shù)甘湯、桂枝湯、桃核承氣湯等。

2.2 六經(jīng)病分布各方劑所治療病證以太陽病最多,共出現(xiàn)12次,陽明病出現(xiàn)5次,厥陰病出現(xiàn)2次,少陽病、太陰病、少陰病、太陽合陽明病、太陽合少陰病、太陽合厥陰病、陽明合少陰病、陽明合厥陰病各1次,具體見圖1。

圖1 各方劑治療六經(jīng)病的?；鶊D

2.3 藥物頻次分析所有納入的方劑共23味中藥,應(yīng)用頻率在前20%的藥物分別是甘草、桂枝、茯苓、白術(shù),見圖2。

圖2 各方劑中藥物頻次熱力圖

2.4 藥物四氣五味、歸經(jīng)分析藥物四氣以寒性居多,五味以苦味、甘味、辛味居多,歸經(jīng)依次為脾經(jīng)、胃經(jīng)、肺經(jīng)、心經(jīng)、肝經(jīng),見圖3。

圖3 藥物四氣五味、歸經(jīng)太陽輻射圖

2.5 藥物關(guān)聯(lián)設(shè)定最小支持度10%,最小置信度80%時(shí),獲得兩藥和三藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則。置信度100%時(shí),最大支持度的藥對是白術(shù)和茯苓;置信度80%時(shí),最大支持度的藥對是桂枝和甘草;置信度100%時(shí),最大支持度的三藥是白術(shù)、茯苓和桂枝。見表1、表2。

表1 兩種藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

表2 三種藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.6 藥物聚類聚類圖以標(biāo)尺值10為界點(diǎn),將藥物分成七類,具體見圖4。第一類:柴胡、人參、大棗、生姜、半夏、瓜蔞,功效:和解少陽,兼扶土氣;第二類:葛根、黃連、黃芩,功效:解太陽表邪,清陽明里熱;第三類:水蛭、虻蟲、桃仁、芒硝、大黃,功效:攻瘀逐熱,清降陽明;第四類:白芍,功效:養(yǎng)血斂陰;第五類:附子、干姜、茯苓、白術(shù)、澤瀉、豬苓,功效:溫腎利水,少陰太陽同治;第六類:桂枝,功效:散寒解肌,通陽化氣;第七類:甘草,功效:益氣健脾,調(diào)和諸藥,補(bǔ)中央土氣斡四方。

圖4 藥物聚類圖

2.7 證候與藥物關(guān)聯(lián)涉及的原文證候共36種,以發(fā)熱最多,見圖5。

圖5 證候分布圖

2.8 療效分析納入文獻(xiàn)中共有療效指標(biāo)40種,其中真武湯療效指標(biāo)最多;研究頻數(shù)前20%的指標(biāo)有血肌酐、24 h尿蛋白、尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率、有效率、腎臟病理、中醫(yī)證候、空腹血糖,見圖6。治療組能降低血糖、減少24 h尿蛋白、改善腎組織損傷、提高腎功能、改善中醫(yī)證候、提高有效率等。

圖6 各方劑療效的堆疊玉玨圖

2.9 藥物劑量分析附子、半夏、生姜、大棗用量較固定:附子一枚,半夏半升,生姜3兩,大棗12枚。藥物劑量離散度分析,白芍劑量相對最集中,茯苓最離散,中位數(shù)以白芍劑量最大,見圖7。

圖7 各藥物劑量的云雨圖

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.1 活性成分篩選結(jié)果利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索高頻核心藥物甘草、桂枝、茯苓、白術(shù)有效成分,并限定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18。將所得有效成分通過其化學(xué)名在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)進(jìn)行搜索,得到各成分簡化分子線性輸入規(guī)范(SMILES)。

3.2 化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果將搜索到的SMILES式通過Swiss Target Prediction 服務(wù)器虛擬篩選,共得到核心藥物成分靶點(diǎn)基因754個。篩選活性成分-靶點(diǎn)關(guān)系度≥20%,獲得活性成分桂枝2個,茯苓8個,白術(shù)1個,甘草30個,靶點(diǎn)基因146個,成分-靶點(diǎn)關(guān)系434個。

3.3 疾病靶點(diǎn)獲取在Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetic nephropathy”,得出糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn),以相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥10作為篩選條件,篩選結(jié)果作為疾病的候選靶點(diǎn)基因,共406個。

3.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將得到的成分-靶點(diǎn)關(guān)系以Excel格式導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件中,設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊等基本屬性,得到成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖8。41個節(jié)點(diǎn)代表活性成分,146節(jié)點(diǎn)代表與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)基因。以節(jié)點(diǎn)度degree值反映靶點(diǎn)大小,節(jié)點(diǎn)度>10的成分有GC3(Mairin)、GC30(Licochalcone B)、GC22(kanzonols W)、GC6(Medicarpin)、GC4(Glycyrol)、FL4(Cerevisterol)、FL7(Ergosterol peroxide)、GZ1(taxifolin)、GZ2(beta-sitosterol),節(jié)點(diǎn)度>10的靶點(diǎn)有PTPN1、CYP19A1。

圖8 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用韋恩圖得到成分和疾病共有的潛在靶點(diǎn)29個,導(dǎo)入STRING獲得蛋白相互作用,信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件繪制蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析,以combined score值反映邊的粗細(xì),以節(jié)點(diǎn)degree值反映靶點(diǎn)大小及顏色,從而構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),見圖9。

圖9 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3.6 疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)利用 Cytoscap 3.9.0中的merge功能將成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)合并,得到的疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)為兩個網(wǎng)絡(luò)的重疊部分,見圖10。

圖10 疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3.7 GO和KEGG分析利用Metascape(https://www.metascape.org/)數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,見圖11,生物過程主要涉及肽的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞酮代謝、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等過程;細(xì)胞組分主要涉及膜側(cè)面、溶解液泡、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、膜筏等組分;分子功能主要涉及激素結(jié)合、核受體活性、脂肪酸結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、絲氨酸內(nèi)肽酶結(jié)合等功能。進(jìn)行KEGG通路富集分析,見圖12,通路涉及腫瘤通路、腺苷酸激活蛋白激酶信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖11 GO分析圖

圖12 KEGG通路富集分析圖

4 討論

本研究納入的文獻(xiàn)類型有動物實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究,5項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)研究中結(jié)局指標(biāo)均有腎臟病理結(jié)果,病理結(jié)果示腎小球體積增大、腎小球系膜基質(zhì)增寬、基底膜廣泛增厚等,與人類早期糖尿病腎病病理改變一致[22]。

糖尿病腎病的六經(jīng)辨證中,以太陽病最常見,其次是陽明病。太陽陽氣最盛,為六經(jīng)之藩籬,統(tǒng)攝營衛(wèi)[23-24]。王肯堂《證治準(zhǔn)繩》曰:“人之一身,本乎營衛(wèi)”,營衛(wèi)正常則病不生,營衛(wèi)氣亂則病起,故糖尿病腎病也常從太陽病論治。藥物頻次分析發(fā)現(xiàn)核心藥物是甘草、桂枝、茯苓、白術(shù),桂枝辛溫補(bǔ)陽從皮毛散寒,同時(shí)補(bǔ)火制水;茯苓入肺、脾、腎經(jīng),防桂枝辛溫太過;白術(shù)入脾胃經(jīng),補(bǔ)后天之本;甘草健脾胃,調(diào)和諸藥[25-27]。

藥物關(guān)聯(lián)分析中白術(shù)、茯苓關(guān)聯(lián)度最大,二藥合用,一補(bǔ)一滲,益氣健脾滲濕,以復(fù)中焦運(yùn)化之職;白術(shù)、茯苓配伍桂枝,桂枝溫陽化氣以行水,溫脾、利水之力增強(qiáng)。桂枝配甘草,辛甘化陽,補(bǔ)益之力倍增,祛邪之力更強(qiáng)。聚類分析第一類為小柴胡湯方中藥物,用瓜蔞代替黃芩潤腸泄熱,清熱同時(shí)加強(qiáng)通腑之力;第二類為葛根芩連湯方中藥物,辛涼與苦寒同用,解表又清里;第三類為抵當(dāng)湯方中藥物,合用芒硝以增強(qiáng)泄熱之功;第四類藥物為白芍,白芍乃養(yǎng)陰柔肝第一藥,柔肝可熄風(fēng);第五類為四逆湯合五苓散方中藥物,水為陰邪,賴陽氣化之,陽氣通達(dá),則水濕得化,一補(bǔ)一瀉,補(bǔ)而不留邪,瀉而不傷正;陽虛有寒用桂枝,桂枝溫陽化氣,散寒解表,兼補(bǔ)散于一體。中氣不足,脾失健運(yùn)用甘草,甘草補(bǔ)中,調(diào)和諸藥。

核心藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn),甘草治療糖尿病腎病的活性成分有30個,關(guān)鍵成分有白樺脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W、美迪紫檀素、甘草醇5個;茯苓的活性成分有8個,關(guān)鍵成分有腦甾醇、過氧化麥角甾醇2個;桂枝的活性成分有2個,關(guān)鍵成分分別是紫杉葉素、β-谷甾醇;其中以甘草的白樺脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W作用最顯著。有研究顯示,白樺脂酸有降糖、減少氧化應(yīng)激、抗炎、維持線粒體穩(wěn)定、抗凋亡的作用[28-31]。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多因素相關(guān),白樺脂酸可以從多個靶點(diǎn)保護(hù)腎臟。核心藥物治療糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn)有29個,其中以非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1、細(xì)胞色素P450超家族芳香化酶19A1為關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1可以使PI3K/Akt上游分子IRS1發(fā)生去磷酸化,從而抑制胰島素信號通路的傳導(dǎo),參與胰島素抵抗[32-33]。細(xì)胞色素P450超家族芳香化酶19A1基因多態(tài)性與糖代謝相關(guān),推測非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1與細(xì)胞色素P450超家族芳香化酶19A1可以從糖代謝途徑保護(hù)腎臟。GO分析生物過程肽的反應(yīng)最強(qiáng)烈,細(xì)胞組分膜側(cè)面最突出,分子功能激素結(jié)合反應(yīng)最常見。KEGG分析發(fā)現(xiàn),除腫瘤通路外,腺苷酸激活蛋白激酶信號通路最活躍。