龜甲膠研究發(fā)展探析*

李晴,朱香梅,石雨荷,朱玨,童巧珍,2,3

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208; 2.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室,湖南 長沙 410208; 3.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410208

龜甲膠的主要原材料是龜甲,龜甲來源于龜科動物烏龜?shù)谋巢考讱ぜ案共考讱1-2],是龜甲經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠,含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素,有增強(qiáng)人體免疫功能、耐缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、促進(jìn)消化道吸收、延緩衰老、改善造血功能、促進(jìn)骨愈合等作用[3-4]。因其功效顯著且藥性平和,為藥食同源之品,相關(guān)研究也越來越多。基于此,筆者從龜甲膠炮制提取工藝及鑒別技術(shù)、化學(xué)成分、藥理作用以及現(xiàn)代運(yùn)用4個(gè)方面對龜甲膠的研究闡述如下。

1 炮制提取工藝及鑒別技術(shù)

1.1 炮制提取工藝“龜甲膠”一詞首次出現(xiàn)在《四川中藥志》中,也被稱為龜膠、龜板膏等[5]。龜甲膠是龜甲經(jīng)過熬制提取的精華,經(jīng)相關(guān)炮制后制成具有養(yǎng)陰作用的純陰之品,在臨床中與其他藥物配伍使用可調(diào)和陰陽,且其滋陰之力比單純運(yùn)用龜板效果更佳。《本草求真》云:“龜膠專入腎,經(jīng)板煎就,氣味益陰?！惫省渡褶r(nóng)本草經(jīng)》有板不如膠之說。《本草必用》言:“中濕有毒,煎膠用良。”現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[6],經(jīng)過炮制后的龜甲膠有害元素含量低于龜甲,且藥效高于龜甲。膠類藥物最常見的炮制方法之一是蛤粉燙[7],其主要目的是運(yùn)用蛤粉降低膠類中藥的黏膩之性,矯正膠類的不良?xì)馕?使膠類質(zhì)地更加酥脆,利于入丸、散劑?！兜门浔静荨费?“止嗽,牡蠣粉炒。養(yǎng)血,酒蒸化?！薄吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《藥典》)規(guī)定:“龜甲膠味咸、甘,性涼;歸肝、腎、心經(jīng);其制法為:將龜甲漂泡洗凈,分次水煎,濾過,合并濾液(或加入白礬細(xì)粉少許),靜置,濾取膠液,濃縮(可加適量的黃酒、冰糖及豆油)至稠膏狀,冷凝,切成塊,晾干,即得”。

隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步,龜甲膠的炮制工藝也有了較大改進(jìn)。劉艷等[7]采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選制備龜甲膠過程中龜甲的炮制方法以及煎煮次數(shù),結(jié)果龜甲經(jīng)過48 h蒸制去腐肉,不燙淬,煎煮3次后,膠汁中4種氨基酸含量總和能夠達(dá)到較高水平,工藝重復(fù)性良好,考慮到生產(chǎn)成本因素,結(jié)合實(shí)地調(diào)研結(jié)果,廠家多采用煎煮兩次的工藝,因此建議龜甲煎煮2次后,濾過骨渣的膠汁可繼續(xù)用于下一次生產(chǎn)。左蘊(yùn)澤等[8]考察了龜甲炮制加工中的加壓提取時(shí)間、煎煮次數(shù)、煎煮加水量、壓力大小等因素對出膠率的影響,發(fā)現(xiàn)龜甲在煎煮壓力為80 kPa,煎煮時(shí)間為3 h,酌情加5倍水量,煎煮2次最為合適。微波技術(shù)是用于炙阿膠、龜甲膠、鹿角膠膠珠的代表性技術(shù),具有可靠性高、成本低、高效環(huán)保等特點(diǎn)[9]。程一帆等[10]采用正交法優(yōu)選微波工藝炮炙龜膠珠時(shí)發(fā)現(xiàn),膠材質(zhì)量以及微波設(shè)備使用環(huán)境等存在較大的差異,龜膠珠的炮制工藝方法需要依據(jù)不同批次的膠類進(jìn)行調(diào)試,因此,炮制前需要用小批量樣品進(jìn)行測試以確定最佳炮制參數(shù)。另外,龜甲膠為固體膠類,服用需“烊化兌服”,速溶龜甲膠沖劑為新研制的顆粒劑[11],是一種較為理想的新劑型。

1.2 鑒別技術(shù)由于膠類中藥需求量較大,且龜甲膠價(jià)格較高,摻假現(xiàn)象也屢見不鮮?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定了龜甲膠性狀鑒別特點(diǎn)是顏色呈深褐色,質(zhì)硬而脆,斷面光亮,對光照視時(shí)呈半透明狀,氣微腥,味淡,但運(yùn)用性狀判斷其真?zhèn)?不僅對鑒別人員的要求較高且較為復(fù)雜,因此需利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù),以達(dá)到快速、高效鑒別的目的。唐敏等[12]通過UPLC-QTOF/MS技術(shù)建立了一種區(qū)分巴西龜龜甲膠和中華草龜龜甲膠的方法,采用胰蛋白酶對龜甲膠樣品進(jìn)行酶解,然后測定其酶解肽段以進(jìn)行比對,通過軟件區(qū)分二者之間各自的特征肽段以達(dá)到鑒別目的。殷學(xué)毅[13]利用熱分析法對龜甲膠等三種膠類進(jìn)行區(qū)分,將樣品放于熱分析儀樣品室,在空氣氣氛下,以每分鐘5 ℃的速度從20 ℃勻速升到550 ℃,獲得不同樣品的微商熱重曲線和差熱分析曲線,根據(jù)曲線的特征差異進(jìn)行區(qū)分鑒別,此方法成功率高且清晰直觀,也可用于龜甲膠與黃明膠、豬皮膠等其他膠類區(qū)分。綜上,為保證中藥臨床使用的安全性和有效性,應(yīng)逐步完善龜甲膠鑒別技術(shù)。

2 化學(xué)成分

化學(xué)成分的研究對傳統(tǒng)中藥的發(fā)展至關(guān)重要,有效的化學(xué)成分對于后期的藥效研究,相關(guān)機(jī)制研究及毒理研究都具有重要意義。目前發(fā)現(xiàn),龜甲膠的化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等。

2.1 蛋白質(zhì)與氨基酸龜甲膠類似阿膠、鹿角膠等膠類,它的主要組成成分是蛋白質(zhì)[14]。李春梅等[15]采用激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析龜甲膠的蛋白質(zhì)及肽成分,獲得了 6 個(gè)肽分子量峰,形成了龜甲膠蛋白質(zhì)/肽的組分質(zhì)量指紋圖譜,可作為龜甲膠的數(shù)字質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),但龜甲膠蛋白質(zhì)/肽成分最終會水解為氨基酸,這可能并不代表傳統(tǒng)中藥在發(fā)揮藥效時(shí)的物質(zhì)。氨基酸是龜甲膠中含量最豐富的化學(xué)成分,也是《藥典》中明確規(guī)定龜甲膠質(zhì)量控制的重要檢測指標(biāo)。目前,龜甲膠中已分離鑒定出17種氨基酸,包括蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、組氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和賴氨酸等。郭尚偉等[16]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定出龜甲膠中各氨基酸的含量,其中以甘氨酸和脯氨酸的含量最多。

2.2 微量元素龜甲膠中含有多種對人體有益的微量元素如鉻、鈷、銅、鐵、鉬、硒、鋅和錳等,對維持人體健康起著重要作用[17-18]。微量元素的含量測定方法包括原子吸收分光光度法[19]、火焰光度法[20]、電感耦合等離子體光譜法[21]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[22]等。王雨華等[23]通過電感耦合等離子質(zhì)譜法對龜甲膠和鹿角膠中的微量元素含量進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)龜甲膠的鎂、鍶(10.49 mg·kg-1)含量高于鹿角膠,但鋅、銅以及鈣的含量要小于鹿角膠,這可能與鹿角膠長于補(bǔ)陽,而龜甲膠長于補(bǔ)陰有關(guān)。龜甲膠中鍶含量明顯高于鹿角膠,鍶是人體必需的微量元素之一,與骨生長密切相關(guān),且研究表明,鍶具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和抑制破骨細(xì)胞形成的雙重功效[24]。但龜甲膠所含元素并非都是有益元素,袁利杰等[25]通過微波消解龜甲膠樣品,并采用電感耦合等離子質(zhì)譜法測定出了砷、鉛、鉻、鎘、銅和汞6種有害元素含量。目前,其毒理成分與藥效之間的關(guān)系還鮮有報(bào)道,有待進(jìn)一步闡明。

3 藥理作用

3.1 止血補(bǔ)血中醫(yī)常用滋陰藥治療血虛證,龜甲膠“味咸養(yǎng)脈,歸心肝腎經(jīng)”,具有良好的滋陰補(bǔ)血功能[26-27]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,龜甲膠可用于治療虛勞、吐血衄血、崩漏帶下、血虛萎黃等癥[28]。聶淑琴等[11]發(fā)現(xiàn),龜甲膠和速溶龜甲膠顆粒均能縮短小鼠的出血時(shí)間,改善造血功能。胡海林等[29]發(fā)現(xiàn),龜甲膠能夠顯著改善大鼠貧血狀態(tài),增加外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白含量。

3.2 促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖龜甲膠干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎豚鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[30],龜甲膠不僅能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,而且能夠上調(diào)軟骨細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶,修復(fù)受損細(xì)胞,延緩骨關(guān)節(jié)炎的病程發(fā)展。林嘉輝等[31]進(jìn)一步研究了其治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)龜甲膠能減少豚鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞JNK及P38 MAPK基因的表達(dá),促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制凋亡,從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

3.3 抗腫瘤研究表明,龜甲膠可以調(diào)節(jié)免疫,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[32]。唐宇等[33]將龜甲膠用于環(huán)磷酰胺所致的免疫低下大鼠,結(jié)果表明,高劑量龜甲膠能夠提高脾臟指數(shù)、外周血中腫瘤壞死因子-α的濃度及CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)。王龍等[34]發(fā)現(xiàn),龜甲膠在提高機(jī)體免疫力和白細(xì)胞計(jì)數(shù)方面較鱉甲膠更佳。

3.4 抗衰老中藥抗衰老機(jī)制包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、基因損傷修復(fù)等[35-36]。王玨等[37]發(fā)現(xiàn),龜鹿二仙膠可以改善化療后骨髓造血干細(xì)胞的老化,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、減少細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。劉俐等[38]研究表明,龜甲膠能增強(qiáng)陰虛狀態(tài)下機(jī)體抗氧化能力,提高超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量,同時(shí)調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達(dá),延緩衰老。

3.5 生精盛文[39]研究發(fā)現(xiàn),龜甲膠能夠調(diào)節(jié)生精細(xì)胞Bcl-2/Bax凋亡通路,改善大鼠睪丸生精細(xì)胞的生精功能,調(diào)節(jié)線粒體功能等,王策[40]研究發(fā)現(xiàn),龜甲膠可以調(diào)節(jié)性激素水平。

3.6 其他趙澄等[41]研究發(fā)現(xiàn),龜甲膠治療胃潰瘍機(jī)制可能與降低胃液酸度,減少胃泌素分泌有關(guān)。

4 現(xiàn)代應(yīng)用

4.1 治療骨科疾病膝骨關(guān)節(jié)炎是最常見的老年骨代謝疾病[42],病機(jī)為肝腎虧虛、外感風(fēng)寒濕邪等[43-45],龜甲膠具有益腎健骨的作用。常茹等[46]采用龜甲膠聯(lián)合塞來昔布膠囊治療肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者60例,有效率為93.33%。李文順等[47]采用龜鹿二仙膠湯(龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子)治療膝骨關(guān)節(jié)炎120例,有效率為98.3%。

4.2 治療男科疾病少、弱精子癥是臨床男科常見疾病之一[48],屬中醫(yī)學(xué)“精少”“無子”范疇。龜甲膠為血肉有情之品,滋陰養(yǎng)腎,填髓益精,取“精不足者補(bǔ)之以味”之意,用于治療腎陰虧虛型少弱精子癥,療效較好。周海亮等[49]總結(jié)名老中醫(yī)譚新華教授治療男性不育癥經(jīng)驗(yàn)中指出,龜甲膠作為常用藥,治療陰精不足、虛火旺盛型不育癥療效顯著。

4.3 治療婦科疾病圍絕經(jīng)期綜合征病機(jī)為腎氣漸衰、陰陽失衡[50],龜甲膠補(bǔ)腎氣,滋陰潛陽[51],治療圍絕經(jīng)期綜合征療效顯著。邱明英等[52]用龜鹿補(bǔ)腎丸(龜甲膠、鹿角膠、淫羊藿、續(xù)斷、狗脊、菟絲子等)治療功能性無排卵癥,有效率為86.6%,成功受孕率為60.0%。此外,龜甲膠還可以輔助治療慢性盆腔炎、功能失調(diào)性子宮出血、卵巢早衰等[53-56]婦科疾病。

4.4 治療其他疾病龜甲膠的臨床應(yīng)用十分廣泛,除了能夠治療以上疾病外,與其他中藥配伍還可用于更年期失眠、阿爾茲海默病、貧血、抑郁癥、癌癥等疾病的治療中[57-61]。

5 討論

隨著現(xiàn)代研究技術(shù)和方法的發(fā)展,龜甲膠在炮制和提取工藝方面有了新的進(jìn)展,主要成分、藥理作用以及臨床應(yīng)用方面也有了新的發(fā)現(xiàn),但目前仍存在較多問題,建議如下:①拓寬藥源途徑。膠類中藥需求量較大,藥源緊張、價(jià)格昂貴,中華草龜是唯一的藥用物種來源,閉殼龜、巴西龜、鱷龜、海龜?shù)绕渌贩N均不能作為龜甲的藥用資源,一定程度上限制了龜甲膠的藥源途徑。因此,可在做好質(zhì)量控制、藥效研究的基礎(chǔ)上,利用其他龜科動物為原料,拓寬龜甲膠的藥源途徑;②提高鑒別技術(shù)。龜甲膠真?zhèn)坞y辨,黃明膠、豬皮膠以及雜皮膠等均可冒充龜甲膠,應(yīng)提高市場膠類藥材鑒別技術(shù)。首先把控好動物源,應(yīng)用光譜法快速檢測,高效液相色譜法做定量分析;其次測定龜甲膠與其他類似飲片中的標(biāo)志蛋白和多肽,以作為龜甲膠的特征性因子,應(yīng)用熒光定量 PCR、DNA條形碼等新興技術(shù)建立膠原蛋白特征肽段檢測方法,為龜甲膠的專屬性鑒定提供新的方法;③加強(qiáng)研究力度。龜甲膠的化學(xué)成分多為蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素,但藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確,應(yīng)繼續(xù)應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,闡明其藥效基礎(chǔ),為藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù);引入質(zhì)量標(biāo)志物概念,基于新的質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)建立具有動物藥材特色的質(zhì)量評價(jià)體系。