毫針針刺足三里對(duì)失神經(jīng)肌萎縮大鼠穴區(qū)電阻、溫度和能量代謝變化的影響

賴清 王鼎 吳永強(qiáng) 陳波 張婷 司原成 莫曦雅

摘要：目的 研究大鼠脛前肌失神經(jīng)萎縮對(duì)毫針針刺腧穴穴區(qū)電阻、溫度及能量代謝的影響，為不同機(jī)能狀態(tài)影響毫針針刺作用差異的生物醫(yī)學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將32只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常組和肌萎縮組，每組大鼠再配對(duì)分入針刺組和非針刺組2個(gè)亞組。使用A型肉毒素肌肉注射建立大鼠脛前肌化學(xué)性失神經(jīng)支配肌萎縮模型，針刺組針刺“足三里”穴，捻轉(zhuǎn)頻率60次/min，行針5 min，留針10 min，共操作3輪后出針，每日操作1次，連續(xù)3 d。針刺結(jié)束后，測(cè)量穴區(qū)電阻和溫度，切取以穴點(diǎn)為圓心，直徑0.5 cm，深度0.5 cm區(qū)域的組織塊，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)組織中ATP、ADP的含量并計(jì)算ATP/ADP。結(jié)果 針刺正常組大鼠可以降低腧穴的電阻、溫度，提高穴區(qū)ATP/ADP，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；針刺肌萎縮組大鼠能降低穴區(qū)電阻、溫度，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且電阻降低幅度顯著大于正常組（P<0.01）；針刺肌萎縮組大鼠不能提高穴區(qū)ATP/ADP，與正常針刺組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 肌萎縮狀態(tài)下毫針針刺激活腧穴的作用與正常機(jī)體狀態(tài)存在不同，肌萎縮狀態(tài)可明顯減弱針刺對(duì)腧穴ATP/ADP的調(diào)節(jié)幅度，針刺對(duì)肌萎縮的治療作用可能主要通過增強(qiáng)腧穴電敏特性達(dá)成。

關(guān)鍵詞：毫針針刺；腧穴區(qū)域；失神經(jīng)肌萎縮；生物物理學(xué)特性；能量代謝特性

中圖分類號(hào)：R246 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2023）03-0082-05

Effect of Acupoint Resistance， Temperature and Energy Metabolismof Rats with Denervation Muscular Atrophy after Acupuncture at Zusanli Point

LAI Qing， WANG Ding， WU Yong-qiang， CHEN Bo， ZHANG Ting， SI Yuan-cheng， MO Xi-ya

（School of Acupuncture and Massage， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

【Abstract】Objective： To study the effects of denervation atrophy of rat anterior tibial muscle on acupoint resistance， temperature and energy metabolism in the acupoints of acupuncture needles， and to provide experimental evidence for the biomedical mechanism of affecting the effect difference of acupuncture needles in different functional states. Methods： 32 clean SD rats were randomly divided into a normal group and a muscular atrophy group， and each group was paired into two subgroups， acupuncture group and non-acupuncture group. The rat model of chemical denervation muscle atrophy of tibialis anterior muscle was established by intramuscular injection of botulinum toxin type A. The acupuncture group was injected at Zusanli point， the twisting frequency was 60 times /min， the needle was inserted for 5 min， the needle was retained for 10 min， and the needle was extracted after 3 rounds of operation， once a day for 3 consecutive days. After the acupuncture， the resistance and temperature of the acupoint area were measured， and tissue blocks with the acupoint as the center of the circle with a diameter of 0.5cm and a depth of 0.5cm were cut. The contents of ATP and ADP in the tissues were detected and ATP/ADP was calculated by ELISA. Results： The acupuncture in normal group could reduce the resistance and temperature of the acupoints and increase ATP/ADP in the acupoints， and the differences were statistically significant（P<0.01）. The acupuncture in muscular atrophy group could reduce the resistance and temperature in the acupoint area， and the difference was statistically significant（P<0.01）， and the reduction of resistance was significantly greater than that in normal group（P<0.01）. The acupuncture in muscular atrophy group could not improve ATP/ADP in the acupoint area， and the difference was statistically significant compared with that of the normal acupuncture group （P<0.01）. Conclusion： The effect of acupuncture activation on acupoints under the condition of muscular atrophy is different from that of normal body condition. The condition of muscular atrophy can significantly weaken the adjustment amplitude of acupuncture on ATP/ADP of acupoints. The therapeutic effect of acupuncture on muscular atrophy may be mainly achieved through enhancing the electrical sensitivity characteristics of acupoints.

【Key words】Acupuncture Needles; Acupoint Area; Denervation Atrophy; Biophysical Properties; Energy Metabolism Characteristic

針刺效應(yīng)的產(chǎn)生主要受刺激源、介質(zhì)與受體的影響^［1］，穴位激活是產(chǎn)生針刺效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。毫針針刺作為一種外源性刺激，常常能夠引發(fā)腧穴熱敏、電敏和能量代謝特性的改變，是穴區(qū)激活和機(jī)體自體調(diào)節(jié)功能啟動(dòng)的表現(xiàn)^［2-3］。但目前針刺激活腧穴的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制尚不明確，而且機(jī)體作為針刺的受體，不同機(jī)體狀態(tài)對(duì)針刺穴位局部的激活會(huì)產(chǎn)生什么影響，也不清楚。因此，本課題將就針刺腧穴后其生物物理學(xué)特性與腧穴局部組織能量代謝水平變化的相關(guān)性進(jìn)行研究，并觀察失神經(jīng)肌萎縮病理狀態(tài)對(duì)針刺激活腧穴的影響，為揭示毫針針刺作用的生物醫(yī)學(xué)機(jī)制進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)成年SD大鼠32只，體質(zhì)量（200±10）g，雌雄不限，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，每12h明暗交替，自由飲食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組和肌萎縮組，每組16只大鼠。每個(gè)組按照大鼠窩別、體重、活躍度等因素配對(duì)后隨機(jī)分別分入針刺組和非針刺組2個(gè)亞組，每組8只大鼠。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 注射用A型肉毒素（S10970037，蘭州生物制品研究所）、大鼠三磷酸腺苷（ATP）ELISA檢測(cè)試劑盒（ZK-R4622，深圳子科生物公司）、大鼠二磷酸腺苷（ADP）ELISA檢測(cè)試劑盒（ZK-R3711，深圳子科生物公司）、大鼠一磷酸腺苷（AMP）ELISA檢測(cè)試劑盒（ZK-R5101，深圳子科生物公司），水合氯醛（1113A20，北京雷根生物公司）。毫針（0.30 mm×25 mm/2003046，吳江云龍醫(yī)療器械公司），電子天平（WT型，杭州萬特衡器公司），紅外體溫計(jì)（CK-T1503，深圳長(zhǎng)坤科技公司），直流低電阻測(cè)試儀（YP2512，深圳永鵬公司），凍存管（607001，NEST），液氮罐（YDS-20，青島海爾公司）。

1.3 造模方法 采用注射用A型肉毒素肌肉注射制備大鼠失化學(xué)性失神經(jīng)肌肉萎縮模型^［4］。以10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉；大鼠固定后于右側(cè)小腿脛前肌群處使用1 mL醫(yī)用注射器緩慢單點(diǎn)注射1 U（0.1 mL）注射用A型肉毒素（10 U/mL），出針后消毒干棉球按壓針孔5 S。繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后完成造模。

1.4 針刺方法 各組大鼠稱重后，于右側(cè)“后三里”穴^［5］周備皮，以10%水合氯醛（0.3 mL/100g）腹腔注射麻醉，消毒大鼠“后三里”，用0.30 mm×25 mm的一次性無菌針灸針直刺入“后三里”穴區(qū)組織5 mm，捻轉(zhuǎn)頻率為60 r/min（誤差±2 r/min），幅度180°～360°，行針5 min后，留針10 min，重復(fù)3次，每日針刺操作1次，連續(xù)針刺操作3 d。正常組與肌萎縮組由同一人做相同的抓取、固定及針刺。

1.5 檢測(cè)方法和觀察指標(biāo)

1.5.1 腧穴穴區(qū)電阻檢測(cè) 大鼠俯臥位固定，以腧穴為中心，直徑5 mm的圓為電阻觀測(cè)范圍，無關(guān)電極固定在右后肢足掌中，在被測(cè)穴位點(diǎn)和上下左右各1.5 mm處使用探測(cè)電極進(jìn)行電阻檢測(cè)，取平均值進(jìn)行記錄。

1.5.2 腧穴穴區(qū)溫度檢測(cè) 大鼠繼續(xù)俯臥位固定，在“后三里”垂直上方（4.0±1.0）cm用紅外體溫計(jì)進(jìn)行溫度檢測(cè)，每隔10 s記錄1次，測(cè)定1 min，取6次平均值進(jìn)行記錄。

1.5.3 腧穴穴區(qū)ATP/ADP計(jì)算 （1）動(dòng)物取材：大鼠脫頸處死后立即取材：于大鼠右側(cè)后肢進(jìn)一步消毒、備皮，切開皮膚后分別以大鼠穴位點(diǎn)為圓心，取下直徑約0.5 cm、垂直深度0.5 cm的皮下組織塊（重量約200 mg）。按照順序?qū)⑷∠碌慕M織塊逐一用生理鹽水清洗，裝入凍存管并進(jìn)行編號(hào)，放入-20 ℃冰箱暫存，所有動(dòng)物取材完畢后統(tǒng)一放入液氮罐（-196 ℃）保存。（2）ATP、AMP檢測(cè)：將取下的組織塊按ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。（3）計(jì)算ATP/ADP。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，同組內(nèi)針刺與非針刺亞組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行；不同組間針刺或非針刺組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 正常組大鼠攝食、飲水及大小便正常，反應(yīng)機(jī)敏，毛發(fā)整齊有光澤，步態(tài)正常。造模14 d后肌萎縮組大鼠飲食、二便無明顯異常，毛色整潔，右側(cè)小腿脛前肌群較左側(cè)明顯萎縮，腓骨小頭骨性標(biāo)志較左側(cè)明顯凸起，皮下組織消薄，足趾抓地?zé)o力，呈拖趾步態(tài)。正常組和肌萎縮組針刺治療后，穴區(qū)皮膚未見血腫及破損，肌萎縮模型大鼠右側(cè)小腿肢脛前肌萎縮未見明顯好轉(zhuǎn)，爬行時(shí)右后足偶爾可抬離地面，呈拖趾步態(tài)或跛行步態(tài)。

2.2 機(jī)體不同狀態(tài)下毫針針刺力學(xué)刺激對(duì)腧穴電阻的影響 正常組、肌萎縮組在針刺后，穴區(qū)電阻均較非針刺組降低（P<0.01），穴區(qū)溫度均較非針刺組顯著降低（P<0.01），正常組針刺后，穴區(qū)ATP/ADP較非針刺組顯著增加（P<0.01）。見表1。

2.3 機(jī)體不同狀態(tài)下毫針針刺力學(xué)刺激對(duì)腧穴電阻、溫度和ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度的影響 肌萎縮組針刺后腧穴電阻降低幅度大于正常組（P<0.01），肌萎縮組與正常組相比，針刺對(duì)穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度有顯著差異（P<0.01）。見表2。

3 討論

失神經(jīng)肌萎縮是針刺臨床的常見病和適應(yīng)癥，在中醫(yī)學(xué)中屬于“痿證”范疇。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，“治痿獨(dú)取陽明”，陽明經(jīng)絡(luò)之氣合于膝關(guān)節(jié)下、脛骨前緣的足三里穴?，F(xiàn)代研究表明^［6-9］：針刺能提高失神經(jīng)萎縮肌肉肌細(xì)胞橫截面積，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化，減輕肌細(xì)胞凋亡程度，增加肌細(xì)胞濕重，促進(jìn)失神經(jīng)肌萎縮動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

針刺對(duì)穴位的激活有多種表現(xiàn)形式，電阻是較為常見的反映腧穴狀態(tài)的生物物理學(xué)指標(biāo)^［10］。周丹等^［11］觀察針刺時(shí)不同的穴位配伍對(duì)穴區(qū)電阻的影響，發(fā)現(xiàn)不論是合募配穴還是原絡(luò)配穴，針刺即刻及針刺后10分鐘穴區(qū)電阻均有下降。孫艷紅等^［12］利用經(jīng)穴皮膚電阻動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)觀察不同體質(zhì)在校大學(xué)生在針刺足三里、上巨虛20 min內(nèi)穴區(qū)電阻的變化情況，發(fā)現(xiàn)針刺后大部分腧穴的電阻有不同程度的下降，且下降趨勢(shì)不受針刺手法和受試者體質(zhì)的影響。本研究中，針刺組腧穴處的電阻較非針刺組顯著降低（P<0.01），肌萎縮組針刺后的電阻值較正常組更低（P<0.01），針刺前后電阻差值更大（P<0.01），說明針刺能極大地提高腧穴電敏性，在失神經(jīng)肌萎縮狀態(tài)下，穴位的處的導(dǎo)電性能進(jìn)一步提升，可能是是針刺產(chǎn)生治療效應(yīng)的主要因素。

針刺對(duì)溫度的調(diào)節(jié)受到操作方法、選穴及機(jī)體狀態(tài)的影響^［13］。沈書泓^［14］利用紅外熱成像技術(shù)觀察到針刺陰虛體質(zhì)受試者命門穴20min后，其督脈循行線上的各腧穴溫度均顯著降低。張平等^［15］觀察心肌缺血損傷大鼠在針刺內(nèi)關(guān)穴后心包經(jīng)各經(jīng)穴的溫度變化，發(fā)現(xiàn)針刺后內(nèi)關(guān)穴、郄門穴及天泉穴處的溫度均有所下降。本研究采用平補(bǔ)平瀉的操作方法針刺大鼠足三里，觀察到針刺組穴區(qū)溫度顯著降低（P<0.01），且不受失神經(jīng)肌萎縮狀態(tài)的影響。

陳波等^［16］認(rèn)為，針刺效應(yīng)的產(chǎn)生與ATP等能量物質(zhì)的功能與密切相關(guān)。細(xì)胞中ATP、ADP、AMP能相互轉(zhuǎn)化，為組織代謝活動(dòng)提供能量，并維持細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)。當(dāng)組織中供能物質(zhì)ATP不足時(shí)，2個(gè)單位ADP在相關(guān)酶作用下氧化磷酸化為1個(gè)單位ATP和1個(gè)單位AMP，氧化磷酸化的速率主要受ATP/ADP比率的影響^［17］。相關(guān)研究表明，針刺能夠有效提高心肌組織、腦組織、肌肉組織等部位的能量物質(zhì)含量，提升其能量代謝水平^［18-20］，此類研究多聚焦于針刺對(duì)相關(guān)臟腑肌肉能量代謝的影響。本研究關(guān)注針刺干預(yù)對(duì)穴位局部組織能量代謝的影響，發(fā)現(xiàn)正常組大鼠針刺后穴區(qū)ATP/ADP比率得到極大提升（P<0.01），ATP含量處于較高水平。說明正常情況下，針刺后腧穴組織處于高能活化狀態(tài)。肌萎縮組針刺后，ATP/ADP比率與針刺前無明顯變化，但與正常組相比，ATP/ADP的增幅存在明顯差異（P<0.01），說明失神經(jīng)肌萎縮狀態(tài)削弱了針刺對(duì)腧穴處能量代謝的影響。

本研究中針刺正常大鼠使其穴區(qū)處于高能活化狀態(tài)，局部可能存在旺盛的物質(zhì)合成和代謝，組織中神經(jīng)遞質(zhì)、電解質(zhì)、微量元素等富集^［21］，所以腧穴導(dǎo)電性能提升，電阻下降。有研究者認(rèn)為^［2］：針刺對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控可在電敏狀態(tài)下被促進(jìn)，以達(dá)到治療疾病的目的。本研究中肌萎縮病理狀態(tài)下，針刺后穴區(qū)組織電敏性進(jìn)一步提升，可能是針刺產(chǎn)生治療效應(yīng)的重要前提。穴位體表的溫度是皮下組織向上傳遞的熱量與皮膚表面熱量向周圍輻射相平衡的結(jié)果^［22］。本研究中正常大鼠穴區(qū)組織所產(chǎn)生的能量可能更多的供給活躍的物質(zhì)合成代謝，并未完全以熱能的形式釋放至體表，故針刺后穴區(qū)溫度降低；肌萎縮狀態(tài)下穴區(qū)溫度較正常情況沒有差異，針刺后穴區(qū)溫度降低，表明毫針刺激改變了腧穴處的紅外熱學(xué)特性，其作用機(jī)制將待進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，肌萎縮狀態(tài)下毫針針刺激活腧穴的作用與正常機(jī)體狀態(tài)存在不同，肌萎縮狀態(tài)可明顯減弱針刺對(duì)腧穴ATP/ADP的調(diào)節(jié)幅度，針刺對(duì)肌萎縮的治療作用可能主要通過增強(qiáng)腧穴電敏特性達(dá)成。

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（收稿日期：2022-08-20）