山藥(Dioscorea opposita Thunb.)赤霉素合成酶基因 DoGA20ox1的克隆及功能研究

葛明然,張艷芳,邢麗南,趙令敏,張 勇,張曉蒙,劉小燕,霍秀文

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010019;2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,內(nèi)蒙古古巴彥淖爾 015000;3.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000)

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(DioscoreaL.),以塊莖為主要產(chǎn)品器官的單子葉植物[1]。是藥典佳品,滋補(bǔ)佳品[2],被譽(yù)為“中國小人參”。塊莖的生長發(fā)育是受多種因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程,其中激素作為主要影響因素之一,在該過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明,赤霉素影響著塊莖的形成[3-5]。

赤霉素(gibberellins,GAs)作為植物生長發(fā)育的主要激素之一,參與種子發(fā)芽[6]、莖的伸長[7]、果實(shí)的生長及品質(zhì)形成[8]、植株生物量[9]、木質(zhì)素的積累[10]、葉綠素的表達(dá)[11]等。赤霉素合成受內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶、GA-20氧化酶、GA-3氧化酶及 GA-2氧化酶等多個關(guān)鍵酶催化[12]。其中GA20ox是赤霉素生物合成中的關(guān)鍵酶,影響植物生長發(fā)育的復(fù)雜過程,內(nèi)源赤霉素和外部環(huán)境因子對植物生長發(fā)育的調(diào)控均與GA20ox基因的表達(dá)水平有關(guān)[13],因此為探索該過程,分離和驗(yàn)證基因功能是非常重要的。目前,已在芍藥[14]、葡萄[15]等植物中克隆獲得了編碼GA20ox的基因。

本研究以‘畢克齊’長山藥(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和長芋’山藥(D.oppositaThunb.;DHCY)為試驗(yàn)材料,克隆山藥赤霉素合成酶基因DoGA20ox1(Unigene0027812,DoGA20ox1)的開放閱讀框(ORF)及其與cDNA對應(yīng)的gDNA,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及基因結(jié)構(gòu)分析;構(gòu)建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1瞬時(shí)表達(dá)載體,對該基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位;分析DoGA20ox1在2個品種山藥塊莖不同發(fā)育時(shí)期及不同器官的表達(dá)模式差異;構(gòu)建pPZP221-DoGA20ox1植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草。為初步解析GA20ox在山藥塊莖膨大過程中赤霉素合成的分子機(jī)理方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以內(nèi)蒙古主栽品種‘畢克齊’山藥(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和長芋’山藥(D.oppositaThunb.;DHCY)為試驗(yàn)材料。于2020年5月初在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源圃種植,取種植后90 d、105 d、120 d、135 d和150 d的山藥塊莖,3株混樣,3次生物學(xué)重復(fù)。將取好的幼莖、葉和塊莖立即液氮速凍,-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 山藥塊莖總RNA的提取及cDNA合成

參照王金鑫等[16]試驗(yàn)方法,進(jìn)行2個山藥品種不同發(fā)育時(shí)期塊莖、莖及葉的總RNA的提取(TaKaRa Mini Best Plant RNA Extraction Kit)及單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄(TaKaRa ;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA SynthesisKit)。

1.3 DoGA20ox1的ORF的克隆

基于前期山藥轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(2018年由廣州基迪奧生物科技公司測定),篩選赤霉素合成酶基因-GA20ox1(Unigene0027812)。通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)GA20ox1的PCR擴(kuò)增引物(表1)。反應(yīng)體系及程序按照TaKaRa公司Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye說明書操作。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,并將產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測序。

表1 DoGA20ox1相關(guān)的引物序列Table 1 Related primer sequences of DoGA20ox1

1.4 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用下列軟件對DoGA20ox1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析(表2)。

表2 DoGA20ox1生物信息學(xué)分析相關(guān)軟件Table 2 Related software of DoGA20ox1 bioinformatics analysis

1.5 DoGA20ox1 gDNA的克隆

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),參照趙令敏[17]的試驗(yàn)方法克隆DoGA20ox1的gDNA序列( Takala;Premix LaTaqTM),將測序結(jié)果與cDNA序列進(jìn)行比對,分析基因結(jié)構(gòu)。

1.6 DoGA20ox1的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)含有BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的引物(表1),參照王金鑫等[16]的試驗(yàn)方法,構(gòu)建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1載體。提取質(zhì)粒,并通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA 4404,制備侵染液,注射煙草葉片,使用激光共聚焦顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)觀察煙草葉表皮細(xì)胞中GFP的表達(dá)情況。

1.7 DoGA20ox1的表達(dá)分析

以山藥的18S為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)DoGA20ox1qRT-PCR引物(表1),參照王金鑫等[16]的試驗(yàn)方法(TaKaRa試劑盒;TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.8 DoGA20ox1植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

設(shè)計(jì)含有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的DoGA20ox1-ZF/ZR引物,參照邵盈[18]的試驗(yàn)方法構(gòu)建pPZP221-DoGA20ox1載體。提取質(zhì)粒,并通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 101,制備菌液,侵染煙草葉片。經(jīng)共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)及生根培養(yǎng)后,采用PCR和RT-PCR方法分別檢測轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片的DNA和RNA。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖,采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoGA20ox1基因的克隆

以山藥塊莖cDNA為模板,GA20ox1-ORF-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得約1 400 bp的條帶(圖1),回收該克隆條帶,連接轉(zhuǎn)化后送測,經(jīng)比對分析GA20ox1片段大小為1 359 bp,ORF長度為1 152 bp,共編碼383個氨基酸(圖2),將該基因命名為DoGA20ox1。

M. DL2000分子標(biāo)記;1. DoGA20ox1 PCR產(chǎn)物M. DL2000 molecular marker; 1. DoGA20ox1 PCR product圖1 DoGA20ox1的ORF擴(kuò)增Fig.1 DoGA20ox1 open reading frame amplification

圖2 山藥塊莖 DoGA20ox1的ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence of yam tuber DoGA20ox1 and its deduced amino acid sequence

2.2 生物信息學(xué)分析

通過軟件分析,得到DoGA20ox1基因編碼蛋白的理論分子量為97.1 ku,分子式為C3490H5830N1152O1456S308,總原子數(shù)為12 236,理論等電點(diǎn)為5.01。對DoGA20ox1基因所編碼氨基酸組成分析得出,預(yù)測DoGA20ox1編碼的蛋白質(zhì)為親水蛋白,膜外蛋白。該蛋白主要由無規(guī)則卷曲(42.82%),α螺旋(34.73%)延伸鏈 (16.45%),β轉(zhuǎn)角(6.01%)構(gòu)成(圖3)。11個物種GA20ox氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),山藥DoGA20ox1氨基酸序列與幾內(nèi)亞薯蕷(XM_039265410.1)、石斛(XM_020838041.2)、木豆(XM_020349629.2)、木豆(XM_020349471.2)、赤豆(XM_017558479.1)、綠豆(XM_014656961.2)、碧桃(XM_007219460.2)、扁桃(XM_034346565.1)、睡蓮(XM_031637679.1)、綠豆(XM_014656962.2)序列相似性較高,分別為 93.81%、69.19%、 62.73%、62.72%、62.76%、61.93%、61.2%、 61.2%、59.26%、56.52%,且都具有20G-Fe (Ⅱ) oxygenase 保守結(jié)構(gòu)域(圖4)。構(gòu)建 DoGA20ox1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5),結(jié)果表明,山藥與幾內(nèi)亞薯蕷之間的親緣關(guān)系最為相近。

圖3 DoGA20ox1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Secondary structure prediction of DoGA20ox1 protein

圖5 DoGA20ox1及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of DoGA20ox1 and its homologous sequences

2.3 DoGA20ox1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING在線網(wǎng)站,分別以馬鈴薯StGA20ox1為模板構(gòu)建山藥DoGA20ox1的相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示,GA20ox1與赤霉素合成的關(guān)鍵元件如GA2ox(GA2ox1、GA2ox5)、GA3ox(GA3ox1、GA3ox2)作用直接(圖6)。

圖6 DoGA20ox1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Protein interaction network of DoGA20ox1

2.4 DoGA20ox1基因的gDNA克隆

以山藥塊莖DNA為模板,GA20ox1-ORF-F/R為引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,得到長度為1 499 bp的gDNA序列,其包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。4段外顯子長度分別為567、245、77、263 bp,3段內(nèi)含子長度分別為132、105、110 bp(圖7)。

圖7 山藥 DoGA20ox1的cDNA和gDNA序列比對Fig.7 Comparison of cDNA and gDNA sequence of yam DoGA20ox1

2.5 DoGA20ox1的亞細(xì)胞定位

對重組質(zhì)粒CaMV35S-GFP-DoGA20ox1進(jìn)行PCR和雙酶鑒定,PCR(圖8-A)和雙酶切(圖8-B)均獲得與陽性對照大小相同的條帶,說明瞬時(shí)表達(dá)載體成功構(gòu)建,可以進(jìn)行下一步的亞細(xì)胞定位。

A.M1.DL5000 DNA標(biāo)記;+.陽性對照;-.陰性對照;1.PCR;B.M2.DL15000 DNA標(biāo)記;1.酶切鑒定;2.陽性對照;3.重組質(zhì)粒A.M1.DL5000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1.PCR;B.M2.DL15 000 DNA marker; 1.Enzyme digestion identification;2.Positive control;3.Recombinant plasmid圖8 PCR和雙酶切法檢測瞬時(shí)表達(dá)載體CaMV35S- DoGA20ox1Fig.8 Detection of transient expression vector CAMV35S- DoGA20ox1 by PCR and double digestion

注射煙草葉片,2 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)GFP的熒光信號均勻分布于煙草細(xì)胞內(nèi),DoGA20ox1-GFP熒光信號在質(zhì)膜中定位較強(qiáng)(圖9)。

圖9 DoGA20ox1的亞細(xì)胞定位Fig.9 Subcellular localization of DoGA20ox1

2.6 DoGA20ox1基因的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明,在2個品種中,DoGA20ox1的表達(dá)存在差異。B1的DoGA20ox1基因的表達(dá)量呈“升-降-升”的變化趨勢,在150 d時(shí)表達(dá)達(dá)到最高值;DHCY的DoGA20ox1基因的表達(dá)量與B1的變化趨勢一致,120 d時(shí)達(dá)到峰值(圖10-A)。DoGA20ox1基因的表達(dá)水平在山藥塊莖的膨大期,DHCY都顯著高于B1。

A.山藥塊莖膨大期 DoGA20ox1的表達(dá)量變化;B. DoGA20ox1在不同組織中的特異性表達(dá)A.Changes in DoGA20ox1 expression during yam tuber expansion;B.Specific expression of DoGA20ox1 in different tissues圖10 DoGA20ox1的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of DoGA20ox1

DoGA20ox1基因在2品種山藥不同組織中相對表達(dá)量也存在差異。B1中莖的表達(dá)量最高,而DHCY中葉片的表達(dá)量最高。DoGA20ox1基因在B1莖中的表達(dá)量分別為葉和塊莖的2.31倍、29.76倍;在DHCY中,DoGA20ox1基因在葉中的表達(dá)量是莖和塊莖的2.08倍、31.86倍。DHCY葉、塊莖中的表達(dá)量明顯高于B1,為4.29倍、6.9倍。因此,DoGA20ox1基因在山藥中的表達(dá)具有特異性(圖10-B)。

2.7 DoGA20ox1植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為了進(jìn)一步闡明DoGA20ox1的功能,將該基因構(gòu)建到pPZP221-35S-NOS載體中。PCR(圖11-A)和雙酶切(圖11-B)檢測,結(jié)果表明成功構(gòu)建pPZP221-DoGA20ox1植物表達(dá)載體。

A.M1.DL2000 DNA標(biāo)記;+.陽性對照;-.陰性對照;1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA標(biāo)記;1.陽性對照;2.重組質(zhì)粒;3.酶切鑒定A.M1.DL2000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA marker; 1.Positive control; 2.Recombinant plasmid; 3.Enzyme digestion identification圖11 DoGA20ox1植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.11 Construction of DoGA20ox1 plant expression vector

2.8 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測

選取10個轉(zhuǎn)DoGA20ox1基因煙草植株,進(jìn)行DNA提取及PCR檢測。結(jié)果顯示,10個轉(zhuǎn)DoGA20ox1基因煙草植株中,8個株系的擴(kuò)增條帶均與陽性對照大小一致(圖12)。表明DoGA20ox1基因成功轉(zhuǎn)入到煙草的DNA中,且轉(zhuǎn)化率為80.0%。

M.DL2000 DNA標(biāo)記;+.陽性對照;-.陰性對照;CK.野生型煙草;1～10.轉(zhuǎn)基因植株M.DL2000 DNA marker; +.Positive control; -.Negative control; CK.Wild-type tobacco; 1-10.Transgenic plant圖12 轉(zhuǎn) DoGA20ox1基因煙草PCR檢測Fig.12 PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

從PCR檢測成功的8個轉(zhuǎn)基因株系中隨機(jī)提取5個植株(T-6、T-7、T-8、T-9和T-10)的RNA并進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示,5個植株的擴(kuò)增條帶均與陽性對照大小一致(圖13),DoGA20ox1在轉(zhuǎn)錄水平成功表達(dá)。

M.DL2000 DNA標(biāo)記;+.陽性對照;-.陰性對照;CK.野生型煙草;1～5.T-6、7、8、9、10轉(zhuǎn)基因株系M.DL2000 DNA Marker; +.positive control ; -.negative control; CK.Wild type tobacco; 1-5.T-6,7,8,9,10 transgenic lines圖13 轉(zhuǎn) DoGA20ox1基因煙草的RT-PCR檢測Fig.13 RT-PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

3 討 論

GA20ox是赤霉素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控酶,它將非生物活性的GA53和GA12氧化為生物活性的GA20和GA9,進(jìn)而調(diào)節(jié)赤霉素的含量。該酶屬于20G-Fe (Ⅱ) oxygenase的雙加氧酶,是一個2-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶超家族保守結(jié)構(gòu)域,2-酮戊二酸和Fe2+能與底物相互作用發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而催化赤霉素生物合成過程中不同的羥基化和去飽和步驟[19]。GA20ox也是目前研究最多的限速酶,先后克隆了30多種植物的GA20ox基因序列[20],其中包括馬鈴薯[21]、萵苣[22]等根莖類植物。GA20ox氨基酸序列與其他物種的同源性一般在50%～60%;并且植物GA20ox蛋白在進(jìn)化方面較為保守,與同科植物的蛋白同源關(guān)系較近[13]。本研究克隆山藥塊莖的DoGA20ox1基因,該基因編碼的氨基酸與幾內(nèi)亞薯蕷具有較高的相似度,為93.81%;同時(shí),該氨基酸序列包含20G-Fe (Ⅱ) oxygenase保守結(jié)構(gòu)域,這與GA20ox屬于雙加氧酶相吻合。

蛋白質(zhì)是生物功能的直接體現(xiàn),因此對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位也是必不可少的環(huán)節(jié)之一。Wang等[23]克隆了碭山酥梨PbGA20ox2基因,氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)了2OG-Fell_Oxy保守結(jié)構(gòu)域,該基因位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和質(zhì)膜中。姜志昂等[24]克隆的蘋果MdGA20ox1基因及閆蒙舉等[25]克隆的葡萄VvGA20ox1、VvGA20ox2基因均定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜。本研究山藥DoGA20ox1基因亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,該基因定位于質(zhì)膜。GA20ox的定位模式多樣,可能因品種而異,也可能由于發(fā)揮的功能不同。

每個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的量受到多種因素的調(diào)節(jié),并且在植物發(fā)育的不同階段或不同的組織水平上有所不同。GA20ox基因在不同植物中有特異性表達(dá),主要表達(dá)在嫩葉、種子、新芽、莖和花中。芍藥PlGA20ox基因在各器官中均有表達(dá);其中芽的表達(dá)量最高,花瓣次之,根等表達(dá)量較低[14]。GA20ox1基因在草地早熟禾葉片中表達(dá)量最高,在根中表達(dá)量較低[25]。番荔枝AsGA20ox基因在種子、幼莖段表達(dá)量較高[26]。GA20ox基因表達(dá)還可能與內(nèi)源赤霉素的生成量呈相關(guān)關(guān)系,從而促進(jìn)塊莖類植物結(jié)塊[27]。敖蘭吉亞等[5]研究結(jié)果表明B1的GA3含量由塊莖膨大中期末至塊莖膨大盛期呈明顯下降趨勢,而DHCY的塊莖形成的時(shí)間,比B1早15 d左右。王金鑫等[16]測定B1和DHCY塊莖的赤霉素含量顯示,B1的赤霉素含量高于DHCY。本研究結(jié)果表明,DoGA20ox1的表達(dá)水平在B1和DHCY中存在差異,在山藥塊莖的膨大期,DHCY都顯著高于B1。由此表明,低濃度的赤霉素含量可能會促進(jìn)塊莖形成,還有待進(jìn)一步研究。本研究還構(gòu)建了DoGA20ox1基因的過表達(dá)載體pPZP221-DoGA20ox1,可為后續(xù)探究DoGA20ox1基因在山藥塊莖發(fā)育中的功能奠定理論基礎(chǔ)。