干旱脅迫下沙棘NAC基因的時(shí)空表達(dá)模式

張 丹,馬紅榮,段勛軍,喬維范,耶芳芳,馬 強(qiáng),冶貴生,馬玉花

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810016; 2.海東市樂都區(qū)下北山林場,青海海東 810699;3.西寧市西山林場,西寧 810016)

干旱脅迫是影響全球作物產(chǎn)量最重要的環(huán)境因子。在過去的10 a,全球變暖顯著增加干旱發(fā)生的頻率[1-2]。目前,世界上大約三分之一的國家面臨不同程度的水資源短缺,但預(yù)計(jì)水資源可獲得性將進(jìn)一步下降20%～70%[3],這不僅增加了干旱的頻率,同時(shí)也提高了植物高效利用水資源的需求,還會(huì)引發(fā)糧食短缺、木材的有效供給降低、農(nóng)民種植業(yè)經(jīng)濟(jì)效益受損等一系列社會(huì)問題。因此,研究植物的抗旱機(jī)理,提高植物的耐旱性從而節(jié)約水資源尤為重要。在長期進(jìn)化過程中,為了響應(yīng)干旱脅迫以確保在缺水環(huán)境中生存,植物在分子、生化、生理和發(fā)育水平上形成一系列復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制[4-5]?；虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是最重要的調(diào)控機(jī)制之一,轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors TFs)與特定順式作用調(diào)控元件(Cis-Acting Regulatory Elements CAREs)上的DNA結(jié)合,從而決定轉(zhuǎn)錄的起始,激活或抑制應(yīng)激誘導(dǎo)基因的表達(dá)[6],是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[7]。

NAC(NAM-ATAF-CUC)是最大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8]。NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中,在模式植物水稻和擬南芥中分別鑒定出了151和117個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子[9],在沙棘(Hippophaerhamnoides)中鑒定出177個(gè)NAC家族基因[10]。研究表明NAC家族基因參與調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)各種生理生化過程,包括頂端分生組織、細(xì)胞分裂、次生壁的形成、葉片衰老、開花和種子的形成。此外,NAC家族基因在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中也起著至關(guān)重要的作用,大多數(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子被各種非生物脅迫和生物脅迫誘導(dǎo)[11]。研究表明,干旱脅迫下,小麥(Triticumaestivum)葉片和小麥籽粒中23個(gè)TaNAC基因中,7個(gè)具有葉片特異性表達(dá),5個(gè)具有籽粒特異性表達(dá)[12];對遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensis)的SlNAC1基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥的成活率較高,水分損失率低于野生型和對照組,表明SlNAC1能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性[13]。綜上可知,NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。在植物響應(yīng)干旱脅迫的過程中起著重要的調(diào)控作用。

中國沙棘(Hippophaerhamnoides)是胡頹子科沙棘屬的一種旱生且耐低溫的落葉灌木[14],又名沙棘、醋柳、黑刺等。沙棘雌雄異株,是典型的風(fēng)媒授粉樹種。沙棘根系發(fā)達(dá),萌蘗能力強(qiáng),根系能與放線菌形成根瘤共生體,具有很強(qiáng)的固氮能力[15],且中國沙棘抗旱抗寒性強(qiáng),是理想的改良生態(tài)環(huán)境的人工林造林樹種;此外,沙棘作為一種藥食同源植物,含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分,在沙棘屬植物的葉子和果實(shí)等器官中,含有上百種生物活性物質(zhì),富含維生素類、胡蘿卜素類、黃酮類、甾醇類、氨基酸類、脂肪酸類等多類天然化合物約12類近300種[16]。目前,國內(nèi)對沙棘營養(yǎng)成分的研究很多,據(jù)測定,沙棘原汁的維生素C含量是西紅柿的95.4倍,黃瓜的78.8倍,蘋果的105.5倍[17]。吳帥[18]以10個(gè)中國沙棘種源1 a生幼苗為研究對象,從生長特性、生理生化特征和形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)等方面研究種源的耐旱性,并采用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對不同種源進(jìn)行抗旱性綜合評(píng)價(jià);馬玉花等[19]以青海中國沙棘盆栽苗為材料,研究不同程度干旱脅迫處理對葉片生理指標(biāo)以及保護(hù)酶活性的影響;Zhang等[20]對不同濃度CO2處理的兩個(gè)沙棘品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析,在沙棘對CO2濃度升高的反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)4 740個(gè)差異表達(dá)基因,兩個(gè)沙棘品種的轉(zhuǎn)錄因子WRKY、MYB和NAC的表達(dá)水平有顯著差異;Ye等[10]基于RNA-seq技術(shù),對干旱脅迫下沙棘的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析顯示,在沙棘中有4 438個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,并且有100個(gè)基因在脅迫組和對照組差異表達(dá)。本試驗(yàn)選擇干旱脅迫下中國沙棘差異表達(dá)的8個(gè)HrNAC基因,分析其核苷酸序列特征、編碼蛋白氨基酸數(shù)量及分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì),預(yù)測蛋白的親水性、亞細(xì)胞定位。此外,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究上述8個(gè)基因在干旱脅迫下的時(shí)空表達(dá)模式,從而探究沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)干旱脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料采用青海省湟源縣野生沙棘(Hippophaerhamnoides)種子,采種后去漿、晾曬、除雜、消毒并播于直徑35 cm的塑料花盆中(每盆均勻撒播30粒種子),盆土用育苗基質(zhì)、蛭石、珍珠巖、壤土混合配制,播種后在花盆上覆膜,以維持土壤溫度和濕度,提高沙棘種子的發(fā)芽率,待苗木發(fā)芽后去掉塑料膜,幼苗長至3～5 cm時(shí)間苗,撫育期每4 d澆1次水,15 d施1次hoagland營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的選擇及熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成 通過干旱脅迫下沙棘轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[10],對比干旱脅迫下沙棘中177個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異性,篩選其中差異表達(dá)的8個(gè)基因,設(shè)計(jì)熒光定量引物,基因ID及引物序列見表1。

表1 沙棘NAC家族基因及內(nèi)參定量引物Table 1 Quantitative primers of seabuckthorn NAC family and reference genes

1.2.2 脅迫處理及樣本采集 沙棘幼苗長至 20～30 cm開始進(jìn)行干旱脅迫處理。選取生長健壯、長勢一致的沙棘幼苗,分為對照組(CK)6盆和脅迫組(XP)30盆。對照組正常澆水,脅迫組停止?jié)菜Ｔ诘?天(CK)、第4天(XP1)、第10天(XP2)、第19天(XP3)、第27天(XP4)的8:00-10:00分別采集對照組和脅迫組沙棘的根、莖、葉樣本,沙棘盆栽苗在干旱脅迫第10天葉片出現(xiàn)輕度萎蔫,干旱脅迫第27天出現(xiàn)重度萎蔫,葉片發(fā)黃,葉緣失水變干。持續(xù)干旱脅迫直至沙棘苗萎蔫后(干旱脅迫第28天)早晨復(fù)水,并在復(fù)水后48 h采樣(FS);每次采樣同一個(gè)處理梯度至少采集3盆重復(fù)樣本,所有樣品放置于-80 ℃冰箱中保存,備用。

1.2.3 沙棘NAC家族基因的生物信息學(xué)分析 使用DNASTAR軟件進(jìn)行沙棘HrNAC家族轉(zhuǎn)錄因子的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、核苷酸序列和蛋白質(zhì)親水性分析;使用在線預(yù)測軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測NAC蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 以沙棘各個(gè)樣本的cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系均為 20 μL: 上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、 cDNA 2 μL、RNase-free Water 6.8 μL、SYBR Premix(TAKARA) 10 μL;擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 50 s, 60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的相對熒光定量分析方法為2-ΔΔCt法,采用Excel 2021、SPSS 22對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的序列分析

利用DNASTAR軟件分析8個(gè)沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸和氨基酸序列,圖1是HrNAC1的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列,分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2,8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列中A+T的含量均大于C+G的含量。長度最長的HrNAC蛋白(HrNAC6編碼)361個(gè)氨基酸,最短的蛋白(HrNAC3編碼)103個(gè)氨基酸;其等電點(diǎn)為4.910(HrNAC6編碼)～ 9.264(HrNAC1編碼);此外,8個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體上,HrNAC3轉(zhuǎn)錄因子蛋白還定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

圖1 HrNAC1的核苷酸和氨基酸序列比對圖Fig.1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of HrNAC1

表2 沙棘HrNAC基因的生物學(xué)信息Table 2 Related information of sea buckthorn HrNAC gene

2.2 NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白親水性分析

通過DNASTAR軟件預(yù)測分析沙棘HrNAC蛋白的親水性,由圖2可見,8個(gè)HrNAC蛋白都呈現(xiàn)出疏水區(qū)域較少,連續(xù)分布多個(gè)親水區(qū)域的特點(diǎn),整體屬于穩(wěn)定親水蛋白,該性質(zhì)符合胞內(nèi)蛋白的代謝環(huán)境。

圖2 HrNAC家族蛋白親水性Fig.2 Hydrophilicity of HrNAC family proteins

2.3 沙棘不同組織總RNA濃度

測定結(jié)果表明,中國沙棘各組織總RNA的質(zhì)量濃度均大于100 ng/μL,且OD260/OD280值為1.8～2.2,為了進(jìn)一步驗(yàn)證中國沙棘各組織總RNA的質(zhì)量,對提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖3可見,3個(gè)組織的RNA凝膠電泳圖中 28 S、18 S、5 S條帶清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象,且28 S與18 S電泳條帶的亮度約為2∶1,說明提取的沙棘總RNA完整性良好、無降解,可用于后續(xù)熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

M為DL 2000 DNA Marker條帶,1～21為部分中國沙棘總RNA電泳圖

2.4 干旱脅迫下NAC轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)空表達(dá)模式

2.4.1 在根中的表達(dá)模式 為了研究干旱脅迫下,沙棘根、莖、葉中的NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式,對不同脅迫程度下沙棘根、莖、葉樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖4。8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子中,7個(gè)均顯示差異表達(dá),HrNAC1在根中未表達(dá)。干旱脅迫下,沙棘根中的7個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,不同的基因在不同的干旱脅迫下達(dá)到最大值,其中HrNAC5在脅迫第4天(XP1)時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到峰值;HrNAC1、HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC7、HrNAC8在脅迫第19天相對表達(dá)量最大;HrNAC6在脅迫第27天相對表達(dá)量達(dá)到最大值,此外,8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子復(fù)水后的相對表達(dá)量均急劇下降。

2.4.2 在莖中的表達(dá)模式 在沙棘莖中,8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子均差異表達(dá)。干旱脅迫下,沙棘莖中的8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子中,6個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子(HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC6、HrNAC7、HrNAC8)的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,HrNAC5的表達(dá)下調(diào);HrNAC1、HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC6、HrNAC8在脅迫第19天(XP3)時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到峰值;HrNAC7在脅迫第27天(XP4)達(dá)到峰值;此外,8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子復(fù)水后的相對表達(dá)量均急劇下降。

2.4.3 在葉中的表達(dá)模式 在沙棘葉中,8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子均差異表達(dá)。干旱脅迫下,大部分HrNAC家族轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在脅迫初期(XP1),HrNAC1、HrNAC5的相對表達(dá)量出現(xiàn)小幅下降趨勢,但隨著干旱脅迫的進(jìn)一步加深,其表達(dá)量逐漸上升且高于CK。HrNAC7和HrNAC8的變化極為相似,均表現(xiàn)出緩慢上升-大幅上升(XP4)-快速下降(FS)的趨勢,可能存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控。HrNAC2在XP3達(dá)到峰值,其余7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均在重度干旱脅迫(脅迫第27天)達(dá)到最大值,且8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)水后相對表達(dá)量均快速降低。

3 討 論

沙棘是西北地區(qū)重要的造林樹種,生長適應(yīng)性極強(qiáng),尤其在高海拔等生境惡劣地區(qū)。本研究以沙棘實(shí)生苗為材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果表明:沙棘HrNAC家族轉(zhuǎn)錄因子大部分位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體上,轉(zhuǎn)錄的主要場所在細(xì)胞核,這與NAC轉(zhuǎn)錄因子控制脅迫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的功能一致,同時(shí)表明沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子可能控制某些蛋白質(zhì)的加工和修飾。8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子均屬于穩(wěn)定的親水性蛋白,這與蕎麥、蘋果和冰草中NAC轉(zhuǎn)錄因子的親水性結(jié)果一致[21]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的最大家族之一[22],首次報(bào)道的NAC基因(NAM)與牽?；?Pharbitisnil)頂端分生組織和原基的形成有關(guān)[23]。有研究[24]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下大豆中有22種NAC轉(zhuǎn)錄因子受干旱脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá);番茄的NAC轉(zhuǎn)錄因子JUB1(SlJUB1)在干旱等多種非生物脅迫下表達(dá)增強(qiáng),基因沉默抑制SlJUB1的表達(dá)顯著降低了耐旱性,并且各種抗旱相關(guān)基因表達(dá)減少[25];擬南芥中的基因表達(dá)分析表明,SlNAC8由干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),過表達(dá)SlNAC8的擬南芥對干旱耐受性增強(qiáng)[26];干旱脅迫下,剛毛檉柳過表達(dá)ThNAC24基因會(huì)導(dǎo)致POD(過氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)的活性增強(qiáng),減緩細(xì)胞損傷或死亡,提高剛毛檉柳的抗旱能力[27]。由此可見NAC轉(zhuǎn)錄因子受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),且與植物抗旱性密切相關(guān)。NAC轉(zhuǎn)錄因子受上游轉(zhuǎn)錄因子,如DREBs(脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì))、ABREs(ABA反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)的調(diào)控,DRE/CAT是ABA獨(dú)立通道信號(hào)傳導(dǎo)的順式作用元件,ABRE是依賴ABA信號(hào)傳導(dǎo)的順式作用元件[28]。由此可見,NAC轉(zhuǎn)錄因子即參與ABA獨(dú)立通道的脅迫響應(yīng)調(diào)控,也參與ABA依賴通道的脅迫響應(yīng)過程。在ABA依賴途徑中,NAC受ABA累積的刺激,干旱脅迫會(huì)造成ABA的累積,激活下游相關(guān)的脅迫應(yīng)答基因;在ABA獨(dú)立通道中,NAC接收干旱脅迫信號(hào)刺激后可直接激活干旱脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子,從而激活脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[11]。

沙棘作為中國西北地區(qū)的一種先鋒樹種,具有抗旱、耐寒等優(yōu)良的遺傳特性,是干旱區(qū)、山地等自然環(huán)境惡劣區(qū)域較為理想的人工造林樹種[29],具有很大的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在基因資源開發(fā)上有極大的潛力。本研究在轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上篩選出8個(gè)顯著差異表達(dá)的沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行干旱脅迫下的表達(dá)模式研究,結(jié)果顯示其中7個(gè)具有根特異性表達(dá),8個(gè)具有莖和葉片特異性表達(dá)。在干旱脅迫過程中,沙棘的葉片最為敏感,干旱脅迫對葉片的正常生長影響最大,脅迫下葉片通過減少蒸騰失水和增強(qiáng)吸水來維持組織的正常生命活動(dòng),因此,在本研究中,重度干旱脅迫時(shí)(XP4),沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量大幅上升,從而可能激活下游的干旱脅迫應(yīng)答基因,以增強(qiáng)植物在干旱脅迫下的成活率。植物遭遇干旱脅迫時(shí)主要通過增強(qiáng)根部吸水來維持細(xì)胞內(nèi)外水勢平衡,當(dāng)處于輕度脅迫時(shí),沙棘根部HrNAC基因的表達(dá)量顯著上升,可能激活根部脅迫應(yīng)答基因的表達(dá),提高根毛吸水能力,當(dāng)處于重度缺水時(shí),土壤中的自由水含量極低,沙棘根系吸水很困難,即將永久萎焉時(shí),HrNAC的表達(dá)逐漸下降,可能是沙棘根部的HrNAC累積導(dǎo)致的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[30]。在莖中,HrNAC的相對表達(dá)量較少,植物莖中的維管系統(tǒng)將根系吸收的水分和養(yǎng)分輸送到葉片來維持沙棘的水分平衡,HrNAC的表達(dá)會(huì)激活傳輸過程中維持細(xì)胞水分和滲透平衡相關(guān)基因(如AQP、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等)的表達(dá),以保持葉片中水分和養(yǎng)分的有效供給。復(fù)水后,3個(gè)組織的NAC基因相對表達(dá)量都迅速下降,這是由于復(fù)水后沙棘根系快速吸水,恢復(fù)胞內(nèi)水勢平衡,反饋抑制NAC基因的表達(dá)。在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下沙棘的葉片相對含水量、葉綠素含量以及脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,同時(shí)P5CS和ProDH基因的表達(dá)模式也很好地解釋了脯氨酸含量為何會(huì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢[31];此外,干旱脅迫也誘導(dǎo)AQP基因表達(dá)量的上調(diào)[32],但是這些生理指標(biāo)的變化與NAC轉(zhuǎn)錄因子之間存在著什么樣的關(guān)系以及其下游的調(diào)控基因還需要進(jìn)一步探索驗(yàn)證。綜上可知,NAC轉(zhuǎn)錄因子是沙棘抗旱的重要調(diào)控基因。

植物NAC轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件、增加植物保護(hù)酶等方面增強(qiáng)植物的抗旱性,在后期的試驗(yàn)中,通過這些抗旱相關(guān)基因(如:BADH、AQP、CMO、SOD、POD等)的表達(dá)來進(jìn)一步探究NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,同時(shí)也可以通過酵母雜交技術(shù),篩選NAC轉(zhuǎn)錄因子上下游的基因,以及特異識(shí)別序列,來驗(yàn)證沙棘中的HrNAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗旱的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié) 論

本研究通過軟件預(yù)測表明沙棘HrNAC家族轉(zhuǎn)錄因子大部分位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體上;8個(gè)HrNAC轉(zhuǎn)錄因子均屬于穩(wěn)定的親水性蛋白;熒光定量PCR分析結(jié)果表明,干旱脅迫誘導(dǎo)沙棘HrNAC轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá),且呈現(xiàn)出組織特異性,此外,隨著干旱脅迫程度的加深,大部分沙棘HrNAC基因的相對表達(dá)量都逐漸升高,復(fù)水后急劇下降,說明干旱脅迫下HrNAC轉(zhuǎn)錄因子通過表達(dá)量的升高激活抗旱相關(guān)基因的表達(dá),從而提高沙棘的抗旱性。