基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討茵陳治療急性胰腺炎的作用機(jī)制▲

蒙 諾 覃穎穎 楊慧瑩 唐國都

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530021;2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西南寧市 530021)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種消化系統(tǒng)炎癥性疾病[1]。2016年,全球AP發(fā)病率約為34/100 000[2]。AP以膽源性、酒精性為主[3-4],其主要特征是胰腺自身消化,隨后出現(xiàn)炎癥、水腫、空泡形成、壞死等病理過程,嚴(yán)重時可引起胰腺外器官損傷,目前多以對癥治療為主。在中醫(yī)上,AP屬于“食積腹痛”范疇,以痰濕質(zhì)、肝膽濕熱證為主,痰濕質(zhì)是指在各種先天及后天因素作用下,因飲食攝入過度導(dǎo)致脾運(yùn)化失常,體濕而痰多凝結(jié),痰黏且濁。肝膽濕熱證以濕熱內(nèi)蘊(yùn)為主要特征,肝膽疏泄失常可有身目發(fā)黃、發(fā)熱、脅肋脹痛等證候。臨床上,AP以濕熱、血瘀、肝膽郁熱癥狀為主[5-6]。

茵陳為菊科植物濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分,又稱茵陳蒿、綿茵陳、白蒿等[7],其味苦、辛,性微寒,歸脾、胃、肝、膽經(jīng),具有清濕熱、退黃疸的作用。藥理學(xué)研究表明,茵陳具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解濕熱、保肝利膽等多種功效[8]。目前,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)的理論基礎(chǔ)上,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫如中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行檢索、數(shù)據(jù)挖掘、計(jì)算機(jī)模擬,對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,已被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域[9]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),經(jīng)TCMSP獲取茵陳的有效活性成分及其作用靶點(diǎn),利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,對茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,為今后AP的中藥治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 茵陳有效活性成分的篩選 以“茵陳”為檢索詞,利用TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索茵陳的所有活性成分,并設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作為茵陳有效活性成分的篩選條件,將結(jié)果導(dǎo)入Microsoft Excel軟件。

1.2 茵陳有效活性成分作用靶點(diǎn)的篩選 利用TCMSP的“related targets”功能,獲取茵陳有效活性成分對應(yīng)的全部靶點(diǎn)。運(yùn)用UniProt在線蛋白數(shù)據(jù)庫 (http://www.uniprot.org) 和Perl軟件,對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)換。

1.3 AP相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“acute pancreatitis”為檢索詞,利用GeneCards?數(shù)據(jù)庫 (http://www.genecards.org/)和OMIM?數(shù)據(jù)庫(http://omim.org/)進(jìn)行檢索,其中在GeneCards?數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Relevance score≥10。對兩個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果進(jìn)行合并、去重后,得到AP相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 通過Draw Venn Diagram在線工具 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) 將茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)和AP相關(guān)靶點(diǎn)取交集,繪制韋恩圖,獲得茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)和茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Perl軟件進(jìn)行映射,然后利用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.8.0軟件內(nèi)置的Network Analyzer計(jì)算度值、介數(shù)值。

1.6 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫 (http://string-db.org/),應(yīng)用“Multiple Proteins”功能,設(shè)置物種為人類、置信度>0.7,獲得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)蛋白,邊為各靶點(diǎn)蛋白之間相互作用的關(guān)系,將結(jié)果導(dǎo)出,運(yùn)用R語言將靶點(diǎn)蛋白的連接數(shù)目從高到低進(jìn)行排序。

1.7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)輸入R語言Bioconductor包和ClusterProfiler包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,設(shè)置P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 茵陳的有效活性成分 共篩選出茵陳的有效活性成分13個。其中,柳穿魚黃素和3-[2,3-二氫-2-(2-羥基-1-甲基乙基)-7-(3-甲基-2-丁烯基)苯并呋喃-5-基]丙烯酸的OB值較高,β-谷甾醇、茵陳黃酮、異茵陳蒿黃酮的DL值較高 。見表1。

表1 茵陳有效活性成分的基本信息

2.2 茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)及茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn) 經(jīng)TCMSP篩選得到茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)共860個,去重后獲得茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)150個。經(jīng)GeneCards?數(shù)據(jù)庫和OMIM?數(shù)據(jù)庫篩選得到AP相關(guān)靶點(diǎn)1 198個,去重后獲得AP相關(guān)靶點(diǎn)859個。將茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)和AP相關(guān)靶點(diǎn)取交集,得到交集靶點(diǎn)(茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn))81個。見圖1和表2。

圖1 茵陳有效活性成分的作用靶點(diǎn)和AP相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

表2 茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 “中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.8.0軟件建立“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中共有96個節(jié)點(diǎn)和252條邊。96個節(jié)點(diǎn)中包括中藥類節(jié)點(diǎn)1個、有效活性成分類節(jié)點(diǎn)13個、靶點(diǎn)類節(jié)點(diǎn)81個、疾病類節(jié)點(diǎn)1個,見圖2。使用Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,結(jié)果顯示,在活性成分類節(jié)點(diǎn)中,槲皮素(度值=79,介數(shù)值=0.417 0)、異鼠李素(度值=13,介數(shù)值=0.009 9)、β-谷甾醇(度值=11,介數(shù)值=0.007 9)、3′,4′,5′-三羥基-6,7-二甲氧基黃酮(度值=9,介數(shù)值=0.002 7)的度值和介數(shù)值較高,其中槲皮素的度值和介數(shù)值均明顯大于其余藥物活性成分;在靶點(diǎn)類節(jié)點(diǎn)中,前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS)2(度值=14,介數(shù)值=0.039 4)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1 ;度值=13,介數(shù)值=0.035 8)、PTGS1(度值=10,介數(shù)值=0.022 1)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1;度值=10,介數(shù)值=0.024 3)的度值和介數(shù)值較高,表明這些靶點(diǎn)在茵陳治療AP中起到重要作用。

圖2 “中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將茵陳治療AP的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。運(yùn)用R語言對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行信息整合并繪制成圖,結(jié)果顯示,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞基(transcription factor AP-1 subunit,JUN)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3的連接數(shù)目較多,分別連接88個、80個、74個、72個、64個蛋白,見圖4。說明以上靶點(diǎn)蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用,可能是茵陳治療AP的重要靶點(diǎn)蛋白。

圖3 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 茵陳治療AP的重要靶點(diǎn)蛋白(橫軸表示連接數(shù)目)

2.5 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的GO功能富集分析結(jié)果 根據(jù)富集顯著程度由高至低對GO功能富集分析的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能進(jìn)行排序,選取前10個條目進(jìn)行展示。其中生物過程涉及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對活性氧簇的反應(yīng)、對輻射的反應(yīng)及細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等;細(xì)胞組分涉及膜筏、膜微區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷等;分子功能涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合等。見圖5。

圖5 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的GO功能富集分析柱狀圖

2.6 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果 通過KEGG通路富集分析共獲得152條信號通路,根據(jù)富集顯著程度由高至低對152條信號通路進(jìn)行排序,富集顯著程度位于前20的信號通路見圖6。茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)涉及的信號通路主要為脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycation end-products/receptor of advanced glycation end-products,AGE/RAGE)信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、EB病毒感染、IL-17信號通路等。

圖6 茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

經(jīng)檢索共獲得茵陳有效活性成分13個,包括β-谷甾醇、茵陳黃酮、柳穿魚黃素等。β-谷甾醇屬甾體類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗凋亡等作用[10]。陳鐵民等[11]研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可以減輕幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織炎癥反應(yīng),表明β-谷甾醇具有抗炎作用,其機(jī)制可能與Toll樣受體2/核因子κB信號通路相關(guān)。茵陳中的黃酮類化合物通常具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[12-13]。研究表明,茵陳黃酮對炎癥等引起的疼痛具有緩解作用,且抗氧化及鎮(zhèn)痛作用顯著[14]。柳穿魚黃素是一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用,目前柳穿魚黃素的相關(guān)研究多集中于抗腫瘤效果的分析[15]。

“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖顯示,在活性成分類節(jié)點(diǎn)中,槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇及3′,4′,5′-三羥基-6,7-二甲氧基黃酮的度值和介數(shù)值較高,其中槲皮素的度值及介數(shù)值明顯大于其余藥物活性成分。槲皮素為黃酮醇類化合物,存在于多種植物,具有去除氧自由基、抗炎等作用[16]。研究顯示,采用槲皮素干預(yù)鈴蟾素誘導(dǎo)的小鼠AP模型,小鼠的血清淀粉酶含量、胰腺重量、胰腺病理損傷程度低于或輕于對照組(生理鹽水干預(yù))小鼠[17],表明槲皮素能夠顯著緩解AP癥狀的嚴(yán)重程度。

AP的主要特征是胰酶致胰腺自身消化,引起胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡,并且伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),炎癥細(xì)胞和胰腺腺泡細(xì)胞隨后釋放多種炎癥介質(zhì),其中包括促炎性細(xì)胞因子,如IL-6、IL-1、TNF-α等,這些因子水平上升使得血管通透性升高、白細(xì)胞活化、組織破壞等,而炎癥介質(zhì)的釋放是AP發(fā)病的關(guān)鍵因素,且可加重AP病情,導(dǎo)致胰腺外器官受損[18-19]。在本研究中,PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示AKT1、TNF、JUN、IL-6、Caspase-3等可能是茵陳治療AP的重要靶點(diǎn)。其中,IL-6、TNF參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展,促進(jìn)B淋巴細(xì)胞成熟,加重胰腺炎癥反應(yīng)[20]。有研究表明,在小鼠發(fā)生AP后的初始階段,AKT1-/-小鼠腺泡細(xì)胞受損程度與野生型AP小鼠相似,而隨著AP的進(jìn)展,AKT1-/-小鼠胰腺中的炎癥細(xì)胞浸潤減少,這說明AKT1可以促進(jìn)炎癥反應(yīng),推測AKT1可通過激活核因子-κB信號通路參與炎癥反應(yīng)[21]。JUN表達(dá)于多種炎癥細(xì)胞,可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[22]。

GO功能富集分析結(jié)果顯示,茵陳治療AP相關(guān)靶點(diǎn)涉及的生物過程主要有對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對活性氧簇的反應(yīng)、對輻射的反應(yīng)及細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等;涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、膜微區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷等;涉及的分子功能主要有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,茵陳治療AP的作用機(jī)制與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、EB病毒感染、IL-17信號通路等信號通路有關(guān)。其中,IL-17為重要的信號通路,與炎癥反應(yīng)有關(guān)。IL-17還是一種重要的促炎性細(xì)胞因子,由Th、γδT淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌,在有效的免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用[23]。機(jī)體發(fā)生AP時,胰腺自身消化引起的細(xì)胞損傷可誘導(dǎo)CD4+Th聚集,分泌IL-17,加重炎癥反應(yīng)。目前已有研究表明IL-17與AP的發(fā)生有關(guān),且與器官衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān),建議將IL-17作為AP的預(yù)測標(biāo)志物[24]。臨床研究顯示,IL-17水平可隨AP病情的加重而升高,可能與AP的嚴(yán)重程度相關(guān),可以作為評估AP患者病情嚴(yán)重程度的因素[25]。

綜上所述,茵陳治療AP具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn),茵陳中的β-谷甾醇、茵陳黃酮、柳穿魚黃素等有效活性成分可能通過IL-17信號通路、TNF信號通路等信號通路,作用于AKT1、TNF、JUN等關(guān)鍵靶點(diǎn)而起到治療AP的作用。這為今后深入研究茵陳治療AP的作用機(jī)制提供了思路,但相關(guān)結(jié)論仍需要更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。