糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷機(jī)制的研究進(jìn)展*

康文武, 唐 倩, 嚴(yán)江天, 蘇振宏, 梁鳳霞△

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430061 2腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黃石 435003

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是一項(xiàng)全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn),DN通常由2型糖尿病發(fā)展而來,是慢性腎病和終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因[1]。DN典型表現(xiàn)為持續(xù)的高蛋白尿和腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate,GFR)下降[2]。糖尿病時(shí)高血糖、血流動(dòng)力改變等因素持續(xù)損害著腎小球?yàn)V過屏障(glomerular filtration barrier,GFB),而GFB的改變直接導(dǎo)致了蛋白尿的發(fā)生發(fā)展。高蛋白尿是腎小球病變的標(biāo)志,足細(xì)胞又是GFB的關(guān)鍵組成部分,所以足細(xì)胞損傷是DN發(fā)展的核心機(jī)制[3]。因此,本文闡述了DN中足細(xì)胞損傷模式并分析其多種損傷機(jī)制,旨在為后續(xù)的研究提供思路和方向。

1 足細(xì)胞及其在DN中的損傷模式

足細(xì)胞是一種終末分化的、高度特化的腎小球臟層上皮細(xì)胞,它附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)表面,與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。足細(xì)胞呈星狀,其多個(gè)胞體伸長(zhǎng),這種結(jié)構(gòu)稱為足突(foot processes,FPs);鄰近足細(xì)胞的足突相互穿插交錯(cuò),交錯(cuò)形成的裂隙由一段拉鏈狀的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)連接。與SD組成密切相關(guān)的Nephrin、NEPH1、FAT、Podocin和Ephrin B1等蛋白可跨膜在FPs內(nèi)進(jìn)行信號(hào)分子傳遞。FPs內(nèi)含有密集的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò),其中肌動(dòng)蛋白絲不僅與SD連接,還與GBM上的錨蛋白如α3β1整合素(α3β1 integrin)、肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖等連接。因此,足突與足突之間、足細(xì)胞與基底膜之間形成結(jié)構(gòu)獨(dú)立又高度依賴的存在模式,這種模式對(duì)于維持足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及相互之間的信息交流至關(guān)重要。足細(xì)胞通過釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A來調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化及其通透性。

隨著DN的發(fā)生發(fā)展,腎小球及足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能均發(fā)生改變。糖尿病會(huì)誘導(dǎo)腎小球出現(xiàn)適應(yīng)性的病理變化:GBM增厚、系膜細(xì)胞肥大和增殖、系膜基質(zhì)沉淀等。同時(shí),足細(xì)胞會(huì)發(fā)生骨架重排、足突融合甚至消失,細(xì)胞間緊密連接形成增加,狹縫隔膜長(zhǎng)度減少,甚至足細(xì)胞減少[4]。這些細(xì)胞功能障礙會(huì)導(dǎo)致腎小球內(nèi)毛細(xì)血管通透性的變化和GFB的損傷,并最終導(dǎo)致蛋白尿[5]。因此足細(xì)胞損傷是DN及其進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。足細(xì)胞損傷引起的腎小球病變也是局灶階段性腎小球硬化、微小病變性腎病、狼瘡性腎炎和膜性腎病等疾病的主要病理特征[6-7](圖1)。

圖1 足細(xì)胞損傷的主要病理特征Fig.1 Pathological features of podocyte injury

2 DN狀態(tài)下足細(xì)胞損傷機(jī)制

2.1 糖毒性

高血糖是DN發(fā)生發(fā)展最直接、最主要的危險(xiǎn)因素之一。機(jī)體在高葡萄糖環(huán)境中發(fā)生胰島素抵抗導(dǎo)致葡萄糖代謝異常,部分葡萄糖不依賴胰島素即可進(jìn)入細(xì)胞,它激活了細(xì)胞內(nèi)的糖代謝旁路途徑,如多元醇(polyol)途徑和己糖胺途徑,這導(dǎo)致山梨醇和二?；视偷扔卸局虚g代謝產(chǎn)物的積累[8],而過多的山梨醇氧化成果糖[葡萄糖被醛糖還原酶還原后轉(zhuǎn)化為山梨醇,山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下又氧化生成果糖,其過程均依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)],引起還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD)的值升高,產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)水平升高。此外,果糖可促進(jìn)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)生成,大量的AGEs與其受體RAGE結(jié)合通過激活不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,例如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)和核因子kappa-B(NF-κB)來誘導(dǎo)OS以及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等,這些病理進(jìn)程會(huì)導(dǎo)致大部分腎臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙?？傊?過量的葡萄糖內(nèi)流激活細(xì)胞信號(hào)通路,其中包括二?；视?蛋白激酶C(DAG/PKC)通路、AGEs途徑、多元醇通路和己糖胺通路。這些因素相互作用,從而加重炎癥過程,促進(jìn)了糖尿病狀態(tài)下腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展[9]。

當(dāng)使用醛糖還原酶抑制劑后,明顯減輕了DN小鼠基底膜增厚、系膜基質(zhì)沉淀和足突融合等病理損傷,并提高了足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin和Podocin表達(dá)[10]。有趣的是,Qi等[8]回顧某項(xiàng)大型隊(duì)列研究,對(duì)病程超過50年的1型糖尿病患者按有無DN并發(fā)癥進(jìn)行分組,取腎活檢組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)并進(jìn)行比較分析后得出結(jié)論,沒有DN并發(fā)癥的糖尿病患者中存在更高水平的葡萄糖代謝酶,這些代謝酶與糖酵解通量增加密切相關(guān),是糖尿病患者腎小球免受高糖毒性損害的主要因素。研究者們?yōu)榱俗C明這個(gè)結(jié)論,不管是在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎皮質(zhì),還是體外暴露于高糖環(huán)境的足細(xì)胞,測(cè)得的PKM2或PKM1的蛋白質(zhì)水平均沒有明顯變化。然而,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,PKM2激動(dòng)劑的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了DN小鼠模型中糖代謝異常和線粒體功能障礙;在體外實(shí)驗(yàn)中,PKM2敲低的足細(xì)胞不管是處在高糖環(huán)境還是低糖環(huán)境都出現(xiàn)了明顯的DNA斷裂[8,11]?？梢?在DN高血糖的情況下,除了減少葡萄糖的攝入,在一定程度上增加葡萄糖代謝通量以減少糖毒性損傷是值得進(jìn)一步探索的DN治療策略。

2.2 脂毒性

越來越多的證據(jù)表明,脂質(zhì)代謝異常是DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。過度的脂質(zhì)積累導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞損傷被稱為腎脂毒性。臨床試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示,DN模型血漿中含有高濃度的膽固醇[12]、游離脂肪酸、甘油三酯等[13-14]。足細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)變化高度敏感,足細(xì)胞中脂質(zhì)過度積累可導(dǎo)致線粒體OS、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑、胰島素抵抗、自噬損傷以及炎癥反應(yīng),最終可導(dǎo)致足細(xì)胞肥大、脫離和死亡[7]。

足細(xì)胞脂質(zhì)的積累歸因于脂肪的生成增加和分解減少。與脂肪生成相關(guān)的一些基因是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBP)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ),而PPARα則起誘導(dǎo)脂肪分解的作用[15]。游離脂肪酸過量時(shí),會(huì)經(jīng)由膜蛋白CD36被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)而后合成大量的甘油三酯,與多余的膽固醇一同積聚在脂滴中,這種過量的脂通量對(duì)一些重要的細(xì)胞器(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等)的形態(tài)和功能造成直接的損傷,引起線粒體OS、溶酶體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15],這對(duì)于能量消耗大的足細(xì)胞來說無疑是致命的損傷。AdipoRon是一種脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑,脂聯(lián)素通過誘導(dǎo)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化和PPARα表達(dá)來介導(dǎo)脂肪酸代謝。在給予AdipoRon處理后的db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中觀察到p-AMPK(Thr172)和PPARα等蛋白上調(diào),以及SREBP-1c和iNOS等蛋白水平下調(diào),證明了AdipoRon可以通過改善脂質(zhì)代謝來預(yù)防DN[16]。同樣,在高糖暴露下的人類腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠足細(xì)胞中,AdipoRon被證實(shí)可通過激活細(xì)胞內(nèi)CaMKKβ/p-LKB1(Ser431)/p-AMPK(Thr172)/PPARα通路和下游信號(hào)傳導(dǎo),減少高糖誘導(dǎo)的OS和細(xì)胞凋亡,改善細(xì)胞功能[17]。G蛋白偶聯(lián)受體43(GPR43)是參與膽固醇代謝的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,GPR43基因敲除后的糖尿病小鼠腎臟中膽固醇明顯減少。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)類似,在體外用GPR43 siRNA處理高糖高脂模型足細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),GPR43可通過調(diào)節(jié)早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1(EGR1)途徑上調(diào)低密度脂蛋白受體(LDLR)對(duì)膽固醇的攝取以及抑制自噬介導(dǎo)的膽固醇降解,促進(jìn)足細(xì)胞損傷[12]?？梢?脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)對(duì)于足細(xì)胞功能完整性至關(guān)重要。

2.3 氧化應(yīng)激

OS一直被認(rèn)為是DN發(fā)展的主要機(jī)制之一,與糖脂代謝失衡和血流動(dòng)力學(xué)改變密切相關(guān)[18]。OS是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞的重要因素之一,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種腎細(xì)胞的損傷都與OS相關(guān)[19]。在DN中,AGEs的積累刺激ROS的產(chǎn)生,當(dāng)抗氧化物水平不足以消耗ROS時(shí),多余的ROS則容易引起DNA損傷,從而激活p53及其下游途徑以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體是ROS生成的主要場(chǎng)所,線粒體中的DNA損傷導(dǎo)致線粒體功能障礙,導(dǎo)致足細(xì)胞足突融合、凋亡且脫落以及足細(xì)胞相關(guān)蛋白的減少[20]。

沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1,SIRT1)和AMPK是維持細(xì)胞和全身能量穩(wěn)態(tài)的重要營養(yǎng)感受器,通常在營養(yǎng)過剩時(shí)沉默,在營養(yǎng)消耗的情況下被激活。AMPK與SIRT1二者具有協(xié)同作用,共同發(fā)揮抗氧化特性,在保護(hù)線粒體功能中起著重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示,在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的足細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值明顯降低,線粒體發(fā)生腫脹、裂變等變化,線粒體功能明顯降低[21]。白藜蘆醇(一種SIRT1激活劑)可通過激活SIRT1/PGC-1α途徑介導(dǎo)線粒體保護(hù)作用,降低高糖刺激誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化損傷和凋亡[22]。葡萄籽原花青素B2作為一種強(qiáng)抗氧化劑,在體外研究中被證實(shí)可通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α途徑降低足細(xì)胞中ROS水平和減輕線粒體損傷[23]。可見,通過激活抗氧化途徑來降低ROS水平、保護(hù)線粒體功能是保護(hù)DN中足細(xì)胞免受OS損傷的必要途徑之一。

2.4 炎癥

在DN病理?xiàng)l件下,長(zhǎng)期的OS和糖脂代謝中間產(chǎn)物的積累可誘發(fā)過度的炎癥反應(yīng),慢性炎癥已被公認(rèn)為是DN向ESRD發(fā)展的促進(jìn)因素[24]。在高糖環(huán)境下,內(nèi)皮細(xì)胞釋放白細(xì)胞粘附分子和趨化因子,包括血管細(xì)胞粘附分子-1、細(xì)胞間粘附分子-1和單核細(xì)胞趨化蛋白1等[20],募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤腎組織并促進(jìn)炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β和NF-κB)的產(chǎn)生,這些因子在促進(jìn)糖尿病腎損傷中起關(guān)鍵作用[25-26]。在DN患者的腎組織活檢中觀察到,巨噬細(xì)胞在趨化因子上調(diào)時(shí)浸潤腎組織,并證實(shí)巨噬細(xì)胞在腎臟中的積累是慢性腎臟疾病進(jìn)展的突出特征,與腎小球?yàn)V過率下降和預(yù)后不良密切相關(guān)[27]。

從機(jī)制上來說,JAK2/STAT3/SOCS1信號(hào)通路、AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路、TGF-β/Smad信號(hào)通路和MAPK/NF-κB信號(hào)通路是典型的炎癥信號(hào)通路,炎癥相關(guān)信號(hào)通路被激活時(shí)各通路之間往往發(fā)生串?dāng)_反應(yīng),在介導(dǎo)糖尿病腎損傷中起關(guān)鍵的作用。多項(xiàng)研究表明,當(dāng)上述炎癥信號(hào)通路被抑制時(shí),DN模型中的炎癥因子水平明顯下調(diào),足細(xì)胞相關(guān)蛋白Podocin和Nephrin顯著上調(diào),腎小球病理變化明顯改善[25,28-32]。

2.5 自噬

眾所周知,自噬對(duì)腎臟中所有主要細(xì)胞(包括足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有顯著影響。自噬的主要作用是降解蛋白質(zhì)、去除受損的細(xì)胞器以及調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡。在自噬過程中,p62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合,再與自噬小體膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物,一同在自噬溶酶體內(nèi)被降解。足細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞,沒有分裂能力,因此細(xì)胞內(nèi)的自噬降解系統(tǒng)對(duì)于維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在DN的早期,腎臟暴露于高糖、炎癥和OS等刺激下,出于自我保護(hù)可出現(xiàn)自噬水平上調(diào),但后期由于溶酶體損傷導(dǎo)致自噬過程受到抑制,自噬受損導(dǎo)致腎臟細(xì)胞損傷,出現(xiàn)GBM增厚、系膜擴(kuò)張、足細(xì)胞丟失和大量蛋白尿[33]。有研究發(fā)現(xiàn),50周齡的OLETF大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿伴有足細(xì)胞丟失,在其足細(xì)胞中觀察到有大量受損的溶酶體,并檢測(cè)到p62蛋白水平升高,這些特征均提示自噬水平不足[34]。

在雷帕霉素(mTOR)成員中,雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通過調(diào)節(jié)ULK1磷酸化抑制自噬途徑,抑制細(xì)胞分解代謝。白藜蘆醇可以顯著降低STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟組織的p-mTOR/mTOR水平,并上調(diào)p-ULK1/ULK1以及自噬相關(guān)蛋白(Bclin1,LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)水平,通過改善脂質(zhì)代謝紊亂、抑制細(xì)胞凋亡和激活自噬來阻止足細(xì)胞進(jìn)一步損傷[35-36]。mTOR上游的兩大營養(yǎng)素感受信號(hào)AMPK和SIRT1在DN中受到抑制。AMPK和SIRT1是自噬的正向調(diào)節(jié)因子,一旦被激活,SIRT1可通過去乙?；允上嚓P(guān)蛋白來促進(jìn)自噬。此外,SIRT1可以與AMPK和mTOR通路串?dāng)_,調(diào)節(jié)能量代謝和促進(jìn)自噬,減少細(xì)胞凋亡[37]。由此可見,在糖尿病條件下,自噬在維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。

2.6 表觀遺傳

越來越多的證據(jù)表明,與DN的病理改變相關(guān)的基因不僅受到經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)控,而且還受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控[38]。表觀遺傳機(jī)制是指在不改變基礎(chǔ)DNA序列的情況下,與DN相關(guān)的基因和表型對(duì)長(zhǎng)期不利刺激因素存在的環(huán)境作出相應(yīng)改變,且這種改變具有遺傳性。其主要涉及到染色質(zhì)組蛋白修飾、DNA甲基化和非編碼RNA方面。這也可以解釋為什么對(duì)DN進(jìn)行血糖控制后,癥狀仍然會(huì)持續(xù)存在,這種現(xiàn)象被稱之為代謝記憶[38-39]。表觀遺傳學(xué)在與DN發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的病理生理過程的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用,包括腎小球病變、腎纖維化、慢性炎癥和其他病理特征[40]。

SIRT6是Ⅲ類NAD依賴性組蛋白去乙?；?有研究發(fā)現(xiàn),SIRT6特異性缺失加劇了DN患者足細(xì)胞缺失和蛋白尿癥狀,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRT6是通過降低Notch1和Notch4啟動(dòng)子區(qū)域中的組蛋白H3K9乙酰化水平,從而降低了足細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,改善了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂,上調(diào)了Nephrin和Podocin水平,同時(shí)也恢復(fù)了足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平[41]。在足細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子Sp1與NF-κB p65相互作用,Sp1/NF-κB p65復(fù)合體直接參與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1,Dnmt1)調(diào)控。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明,在使用DNA甲基化抑制劑治療db/db小鼠后,蛋白尿明顯減少,腎小球肥厚、系膜基質(zhì)擴(kuò)張和足細(xì)胞損傷得到了明顯改善。另外高糖誘導(dǎo)下的足細(xì)胞中Dnmt1、Sp1和NF-kBp65的表達(dá)明顯增加,而在Dnmt1特異性敲除后又抑制了足細(xì)胞SD蛋白的減少[42]。同樣的,非編碼RNA的表達(dá)失調(diào)也與DN的發(fā)展密切相關(guān)。miR-192是第1個(gè)被報(bào)道與DN相關(guān)的特異性miRNA[43],miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-126-3p、miR-192-5p、miR-214-3p和miR-342-3p也在隨后的研究中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)與DN的損傷機(jī)制密切相關(guān)[40]。值得注意的是,miRNA既受DNA甲基化和組蛋白修飾的調(diào)節(jié),部分miRNA又可對(duì)DNMTs和組蛋白脫乙酰酶的水平進(jìn)行調(diào)節(jié),這些基于遺傳學(xué)的證據(jù)對(duì)于闡釋DN的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要(圖2)。

3 結(jié)語

DN發(fā)展的病理機(jī)制十分復(fù)雜,涉及遺傳因素、表觀遺傳因素和環(huán)境之間的相互作用。盡管足細(xì)胞損傷在腎小球疾病中的地位已被證實(shí),但是目前靶向足細(xì)胞損傷的治療方法仍然十分缺乏。足細(xì)胞和足細(xì)胞相關(guān)分子有可能作為生物標(biāo)志物用于糖尿病腎損傷的早期診斷。所以,充分了解足細(xì)胞損傷的機(jī)制,找到參與足細(xì)胞損傷的重要基因分子和通路。對(duì)于后續(xù)探索靶向足細(xì)胞的治療方法至關(guān)重要。

圖2 足細(xì)胞的損傷機(jī)制Fig.2 Mechanism of podocyte injury