再生障礙性貧血患者RNA互作網(wǎng)絡(luò)分析及潛在治療藥物預(yù)測(cè)*

王紫寧, 陳浩然, 張鈞棟, 李泓毅, 張昊軍, 盧學(xué)春△

1解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853 2中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心血液病科,國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100853 3山西醫(yī)科大學(xué)管理學(xué)院,太原 030604

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種以全血細(xì)胞減少和骨髓過度脂肪化為特點(diǎn)的可危及生命的骨髓衰竭性疾病。AA在亞洲的發(fā)病率較歐美國(guó)家高出2～3倍,其年發(fā)病率在中國(guó)為0.74/10萬人口[1]。骨髓中T細(xì)胞異?；罨碌淖陨砻庖弋惓Ｊ茿A的發(fā)病機(jī)制之一,其可促進(jìn)TNF-α、INF-γ在內(nèi)的多種細(xì)胞因子釋放,從而通過Fas/FasL信號(hào)途徑誘導(dǎo)造血干細(xì)胞凋亡。miRNA是一組長(zhǎng)度在18～23個(gè)核苷酸的保守非編碼小分子RNA,可通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)節(jié),在RNA沉默和基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用,影響生物學(xué)進(jìn)程。已有研究證實(shí)重型急性再生障礙性貧血患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞中miR-126-3p、miR-145-5p、miR-223-3p表達(dá)下調(diào)[2],而miR-150-5p和miR-146b-5p水平上調(diào)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是人體免疫平衡的重要環(huán)節(jié),而大多數(shù)自身免疫性疾病中往往存在著Treg的數(shù)量不足或功能缺陷,AA患者Treg數(shù)量減少且功能受損[3-4]。然而,miRNAs及其靶向mRNAs在T細(xì)胞活化和AA發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚未明確。因此,本研究通過生物信息學(xué)方法篩選AA患者T細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA,構(gòu)建T細(xì)胞的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選得到二甲雙胍具有潛在治療作用。為了解其治療難治性AA的療效及安全性,本文在原有研究[5]基礎(chǔ)上,繼續(xù)納入難治性AA患者進(jìn)行療效分析,以期為難治性AA的藥物治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AA相關(guān)RNA-seq數(shù)據(jù)篩選

以“aplastic anemia”為檢索詞在GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索再生障礙性貧血相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集的納入標(biāo)準(zhǔn)如下:①物種為人;②實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完整,且疾病組與正常對(duì)照組樣本量均包含2例或2例以上重復(fù)對(duì)照;③疾病組與正常對(duì)照組的樣本細(xì)胞系均為T細(xì)胞。最終,基于GPL14613(Affymetrix基因芯片miRNA 2.0陣列)平臺(tái)的GSE82095數(shù)據(jù)集和基于GPL24676[Illumina NovaSeq 6000(Homo sapiens)]平臺(tái)的GSE181989數(shù)據(jù)集符合標(biāo)準(zhǔn),并被選作后續(xù)分析。所選數(shù)據(jù)集中樣本的特征如表1所示[6]。

表1 所選數(shù)據(jù)集樣本臨床信息Table 1 Clinical data of samples from the selected datasets

1.2 miRNA與mRNA的差異表達(dá)分析

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE82095的miRNAs原始表達(dá)數(shù)據(jù)集和GSE181989的mRNAs系列矩陣文件。對(duì)于芯片數(shù)據(jù),使用R語言中affy包進(jìn)行背景校正、歸一化,使用limma包進(jìn)行差異分析得到差異表達(dá)mRNAs(differential expression mRNAs,DE-mRNAs)。使用穩(wěn)健的多數(shù)組平均(robust multi-array average,RMA)算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,并使用K近鄰(K Nearest Neighbor,KNN)進(jìn)行缺失值估算,采用貝葉斯t檢驗(yàn)篩選正常對(duì)照組和疾病組差異表達(dá)基因;對(duì)于RNA-seq數(shù)據(jù),使用seurat包[7]進(jìn)行差異分析,得到差異表達(dá)miRNAs(differential expression miRNAs,DE-miRNAs)。篩選DE-mRNAs和DE-miRNAs的閾值為P<0.05且|log2FC|>0。

1.3 DE-miRNAs靶向mRNAs的鑒定

通過miRNet(https://www.mirnet.ca/)miRNA綜合分析工具,集成了18個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(包括miRTarBase、TarBase、miRecords、SM2 miR、PharmacomiR、HMDD、miR2 Disease、PhenomiR、EpimiR、starBase、TransmiR、ADMIRE、PolymiRTS、SNP2TFBS、TSmiR、IMOTA、ExoCarta、TAM)中的高可信度miRNA靶相互作用數(shù)據(jù),預(yù)測(cè)DE-miRNAs的靶向mRNAs[8]。

1.4 mRNA與miRNA的負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

因?yàn)閙iRNA通常與靶向mRNA之間存在著相反的表達(dá)關(guān)系,將miRNet預(yù)測(cè)的靶向mRNAs與DE-mRNAs進(jìn)行比較,識(shí)別出重疊的mRNAs。然后將兩組之間重疊的mRNAs與DE-miRNAs進(jìn)行負(fù)相關(guān)配對(duì)(miRNA上調(diào)與mRNA下調(diào)、miRNA下調(diào)與mRNA上調(diào)),并將其定義為失調(diào)mRNA。

1.5 功能基因注釋與通路富集分析

使用R包ClusterProfiler和EnrichPlot對(duì)異常mRNA進(jìn)行了基因本體論(Gene Ontology,GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集化分析。

1.6 AA潛在治療藥物篩選

通過本團(tuán)隊(duì)前期建立的表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測(cè)平臺(tái)(EpiMed)對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析,在已知化合物、臨床常用藥物以及中藥中尋找可能對(duì)AA具有治療作用的藥物或化合物,并以關(guān)聯(lián)系數(shù)<-0.1,FDR<0.05為閾值篩選負(fù)相關(guān)藥物。同時(shí)使用KEGG富集分析,對(duì)AA和篩選得到的治療藥物之間的共同作用通路進(jìn)行分析。

1.7 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)

本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),并登記注冊(cè)臨床試驗(yàn)(ChiCTR2000028833)。難治性AA(refractory or resistant aplastic anemia,rAA)為既往曾接受一線IST治療6個(gè)月后疾病尚未緩解,外周血細(xì)胞仍持續(xù)性減少的患者,包括慢性再生障礙性貧血(chronic aplastic anemia,CAA)及重型急性再生障礙性貧血(severe aplastic anemia,SAA),其嚴(yán)重程度分型參照Camitta標(biāo)準(zhǔn)及Bacigalupo標(biāo)準(zhǔn)。在原有針對(duì)27例難治性AA患者的研究[5]基礎(chǔ)上,繼續(xù)納入13例患者作為研究對(duì)象。所有患者均對(duì)本研究知情同意。納入患者標(biāo)準(zhǔn)為:年齡在14周歲及以上,經(jīng)臨床確診為難治性再生障礙性貧血患者;接受過正規(guī)治療,包括環(huán)孢素A(CsA)、抗人胸腺球蛋白和抗人淋巴細(xì)胞球蛋白(ATG/ALG)、雄激素等治療方法,且接受上述治療后效果不佳,根據(jù)療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)診斷為無效或疾病進(jìn)展。

1.8 治療方案

入組患者均接受含鹽酸二甲雙胍聯(lián)合治療方案,具體包括:鹽酸二甲雙胍片250 mg×3/日;環(huán)孢素A膠囊3 mg/(kg·d);司坦唑醇片2 mg×3/日;并根據(jù)患者情況不同,輔以葉酸片、腺苷鈷胺片等口服治療。在HGB<60 g/L,PLT<10×109/L時(shí)分別給予紅細(xì)胞和血小板輸注支持治療。并監(jiān)測(cè)患者在治療期間出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

1.9 隨訪與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

所有患者隨訪至2022年9月31日,失訪患者截止到末次就診時(shí)間。在服用藥物后1、3、6、12個(gè)月進(jìn)行臨床療效評(píng)估。

療效判定參照Camitta標(biāo)準(zhǔn)并略加修改,具體如下:①完全血液學(xué)反應(yīng)(CR):脫離血制品輸注,HGB>100 g/L,ANC>1.5×109/L,PLT>100×109/L,隨訪12個(gè)月以上未復(fù)發(fā)。②部分血液學(xué)反應(yīng)(PR):脫離既往輸血依賴;至少一系血細(xì)胞恢復(fù)至正常或增長(zhǎng)到基線的2倍;任何一系血細(xì)胞基線水平上升并維持3個(gè)月及以上,包括HGB增長(zhǎng)30 g/L以上(治療前<60 g/L)、ANC增長(zhǎng)0.5×109/L以上(治療前<0.5×109/L)、PLT增長(zhǎng)20×109/L以上(治療前<20×109/L)。③無效血液學(xué)反應(yīng)(NR):患者未脫離血制品輸注依賴,癥狀、血常規(guī)未達(dá)PR或疾病進(jìn)展。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有結(jié)果均采用R語言軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)Md(IQR)表示。分類變量使用卡方檢驗(yàn);連續(xù)型變量使用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mRNA與miRNA的差異表達(dá)分析

分別對(duì)AA患者和正常對(duì)照組人群T細(xì)胞mRNA和miRNA表達(dá)譜進(jìn)行差異分析,共鑒定出1261個(gè)DE-mRNAs(471個(gè)上調(diào),790個(gè)下調(diào))和78個(gè)DE-miRNAs(45個(gè)上調(diào),33個(gè)下調(diào))(圖1)。

圖1 AA患者與正常對(duì)照T細(xì)胞中mRNA與miRNA差異分析火山圖Fig.1 Volcano plot of mRNA and miRNA differential analysis in T cells of AA patients and healthy controls

2.2 DE-miRNAs的靶mRNAs預(yù)測(cè)

按照負(fù)調(diào)控原則,預(yù)測(cè)AA中的mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),將DE-miRNAs的靶向mRNAs與DE-mRNAs進(jìn)行負(fù)向配對(duì),最終獲得26個(gè)miRNA與168個(gè)靶向DE-mRNA(失調(diào)mRNA)的調(diào)控關(guān)系(表2),并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

表2 DE-miRNAs調(diào)控方向與靶向mRNAs數(shù)量的關(guān)系Table 2 Relationship between regulatory tendency of DE-miRNAs and number of targeted mRNAs

圖2 DE-miRNAs與失調(diào)mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Regulatory network of DE-miRNAs and targeted mRNAs

2.3 功能基因注釋與通路富集分析

利用GO功能富集分析來研究168個(gè)失調(diào)mRNA的生物學(xué)意義,GO功能包括3類:細(xì)胞組分(cellular component,CC),生物過程(biological progress,BP)和分子功能(molecular function,MF),取GO富集分析中每個(gè)類型前5條結(jié)果進(jìn)行可視化,結(jié)果顯示,AA相關(guān)失調(diào)mRNA可能參與了T細(xì)胞分化、造血調(diào)控、物質(zhì)代謝等過程,主要富集在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及染色體區(qū)等細(xì)胞部位,主要與調(diào)控細(xì)胞代謝、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄、端粒酶RNA結(jié)合等功能相關(guān)(圖3)。對(duì)168個(gè)失調(diào)mRNA進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示,失調(diào)mRNAs主要富集在病毒感染、mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡以及物質(zhì)代謝等信號(hào)通路(圖4)。

圖3 168個(gè)失調(diào)mRNA的GO富集分析結(jié)果Fig.3 GO enrichment analysis result of 168 DE-mRNAs

2.4 AA潛在治療藥物篩選

使用EpiMed平臺(tái)將AA疾病轉(zhuǎn)錄組與藥物相關(guān)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,對(duì)潛在治療藥物進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A、嗎替麥考酚酯、雷帕霉素、二甲雙胍、維生素B、白藜蘆醇、姜黃素等藥物與AA疾病轉(zhuǎn)錄組具有相關(guān)性。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作為降血糖藥物,其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度大于環(huán)孢素A和甲潑尼龍,且具有多個(gè)共同靶點(diǎn)(CD74、IFITM1、IFITM3等)。對(duì)AA具有潛在干預(yù)作用的藥物及其相關(guān)靶分子詳見表3。

圖4 168個(gè)失調(diào)mRNA的KEGG富集分析結(jié)果Fig.4 KEGG enrichment analysis result of 168 DE-mRNAs

表3 EpiMed表觀精準(zhǔn)治療平臺(tái)預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Prediction result of EpiMed epistemic therapy platform

2.5 納入患者基本臨床特征

共納入明確診斷為難治性再生障礙性貧血(rAA)并應(yīng)用含鹽酸二甲雙胍聯(lián)合治療方案患者共40例。患者中位年齡39.6(28,47)歲,其中男17例,女23例,SAA患者12例,CAA患者28例。應(yīng)用含鹽酸二甲雙胍聯(lián)合免疫抑制劑治療前,CAA患者中位病史間期1.98(0.63,4.10)年,SAA患者中位病史間期1.65(0.58,2.96)年,患者治療前的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征詳見表4。兩組患者治療前血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)絕對(duì)值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),其余臨床特征比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 40例rAA患者初診時(shí)基本臨床特征[Md(IQR)]Table 4 Clinical characteristics of 40 patients with refractory aplastic anemia at first hospital visit[Md(IQR)]

2.6 療效評(píng)價(jià)

接受治療的40例rAA患者中,無早期死亡事件發(fā)生。經(jīng)鹽酸二甲雙胍聯(lián)合環(huán)孢素A方案治療后1、3、6、12個(gè)月分別有70%、70%、80%、88%的患者獲得血液學(xué)反應(yīng)。治療后患者的血液學(xué)反應(yīng)例數(shù)及血液學(xué)反應(yīng)率見表5。40例患者在接受聯(lián)合方案治療后12個(gè)月的中位血紅蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)相對(duì)于基線明顯增加。SAA患者血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞水平在治療前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在治療前后的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。CAA患者血紅蛋白、紅細(xì)胞水平在治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。CAA及SAA患者治療前及治療后12個(gè)月的具體療效指標(biāo)見表6。

表5 40例rAA患者經(jīng)鹽酸二甲雙胍聯(lián)合環(huán)孢素A方案治療后療效[n(%)]Table 5 Efficacy of Metformin hydrochloride combined with Cyclosporine A in the treatment of 40 patients with refractory aplastic anemia[n(%)]

表6 40例rAA患者治療前后血液學(xué)指標(biāo)變化Table 6 Changes of hematological indicators of refractory aplastic anemia patients before and after Metformin hydrochloride based therapeutic regimen

3 討論

AA是一種由免疫介導(dǎo)的造血功能衰竭性疾病,主要表現(xiàn)為免疫介導(dǎo)的骨髓造血組織被脂肪替代、造血干細(xì)胞凋亡以及無效造血導(dǎo)致外周血細(xì)胞減少[9]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的微環(huán)境改變及成脂/成骨分化失衡在AA的發(fā)病機(jī)制中同樣起重要作用。近年來,miRNA在免疫細(xì)胞分化、炎癥、自身免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的研究不斷深入,有學(xué)者提出其可作為疾病的潛在生物標(biāo)志物。目前miRNA在AA中的作用機(jī)制尚未完全闡明,既往研究主要關(guān)注miRNA與CD34+細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞之間的關(guān)系,缺乏針對(duì)T細(xì)胞的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。Hosokawa等[2]研究表明,SAA與CAA患者在分別接受免疫抑制治療后,其外周血單核細(xì)胞中存在特征性的miRNA差異表達(dá)譜。miR-126-5p與AA治療的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān),在診斷及治療前miR-126-5p表達(dá)較高的患者無進(jìn)展生存期較短,表明miRNA可作為AA診斷和疾病監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。

本研究通過構(gòu)建AA骨髓T細(xì)胞的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),得到差異表達(dá)的miRNAs,上調(diào)miRNAs主要為hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-4252、hsa-miR-346,其靶向mRNA數(shù)量分別為30、22、20個(gè);下調(diào)miRNAs主要是hsa-miR-4284、hsa-miR-1260b、hsa-miR-635,靶向mRNA數(shù)量分別為20、19、6個(gè)。hsa-miR-199a-5p是miR-199家族成員之一,目前已被證明是乳腺癌、肝癌、肺癌的腫瘤抑制性miRNA[10]。骨髓微環(huán)境中脂肪細(xì)胞在造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)及骨重塑中發(fā)揮著重要作用。miR-199a-5p在PPARγ的調(diào)控下表達(dá)上調(diào),可通過靶向TGFBI促進(jìn)骨髓過度脂肪化,從而增加AA無效造血,加速疾病進(jìn)展[11]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)miR-346通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)Cyclin D1、c-Myc、TCF-1和LEF-1等下游基因表達(dá),從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。此外,在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),miR-346還可靶向抑制HIF-1α/VEGF軸,降低腫瘤血管的生成活性且提高放療敏感性[13],表明miR-346在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、血管生成等方面均發(fā)揮一定作用,與AA發(fā)病機(jī)制相吻合。研究表明,miR-4284可能是不同類型腫瘤及炎癥性疾病的生物標(biāo)志物,具有調(diào)控細(xì)胞凋亡或參與免疫炎癥相關(guān)通路的作用,如過表達(dá)的miR-4284可促進(jìn)胃癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及侵襲[14];強(qiáng)直性脊柱炎患者的MSCs中miR-4284的下調(diào)可導(dǎo)致CXCL5表達(dá)增加,抑制破骨細(xì)胞的生成等[15]。miR-1260b與化療藥物敏感性、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖與凋亡以及腫瘤細(xì)胞遷移等生物學(xué)過程相關(guān),可通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞中HIPK2增強(qiáng)血管生成,因此學(xué)者提出miR-1260b可作為腫瘤疾病診斷或預(yù)后標(biāo)志物[16]。李峻等[17]通過對(duì)AA患者外周血單核細(xì)胞miRNA的分析發(fā)現(xiàn),CAA和SAA患者中miRNA-1260b差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過抑制ETS1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)Th17的分化,在再生障礙性貧血的發(fā)病中發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究表明miR-635可通過靶向PART1影響FUS/EZH2等蛋白的表達(dá),調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路及調(diào)節(jié)免疫進(jìn)程,與腫瘤的生長(zhǎng)密切相關(guān),可作為腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)[18]。

與既往研究相比,本研究篩選得到的的差異miRNAs調(diào)控不同的mRNAs,AA相關(guān)失調(diào)mRNA主要富集在細(xì)胞質(zhì)和染色體區(qū),主要涉及細(xì)胞凋亡、mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt以及IL-17信號(hào)通路等脂向分化級(jí)免疫相關(guān)的KEGG通路。由此,本研究推測(cè)異常免疫系統(tǒng)攻擊造血系統(tǒng)后導(dǎo)致骨髓造血細(xì)胞衰竭,為骨髓脂肪細(xì)胞的分化形成提供了優(yōu)越條件,反之其分泌的多種活性物質(zhì)及脂肪因子也進(jìn)一步影響造血過程,促進(jìn)疾病的發(fā)展。研究表明,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在MSCs的成脂分化中起重要作用,mTOR特異性阻斷劑可擴(kuò)增Treg細(xì)胞,使T細(xì)胞分化偏離促炎性Th1和Th17亞群,從免疫和代謝兩方面調(diào)節(jié)骨髓功能,從而起到治療AA的作用[19]。Li等[20]在AA動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了高濃度的PI3K、p-Akt、p-NF-α、TNF-α等蛋白,表明PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路活躍,應(yīng)用中藥組方可以調(diào)控Akt和NF-κB磷酸化,達(dá)到緩解AA患者骨髓抑制的效果。

目前臨床上針對(duì)AA的治療方案主要為免疫抑制治療和造血干細(xì)胞移植,可使60%～80%的患者完全或部分恢復(fù)自身造血。IST治療雖可使部分AA患者獲益,但患者恢復(fù)自身骨髓造血時(shí)間較長(zhǎng),復(fù)發(fā)和晚期克隆性造血的概率增加,且尚未有藥物針對(duì)骨髓過度脂肪化這一共有現(xiàn)象進(jìn)行治療。因此,本研究使用EpiMed表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測(cè)平臺(tái)對(duì)疾病-藥物進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,篩選得到包括環(huán)孢素A、嗎替麥考酚酯、雷帕霉素、二甲雙胍、白藜蘆醇、姜黃素等在內(nèi)的系列藥物。嗎替麥考酚酯和他克莫司被廣泛應(yīng)用于異體骨髓移植及實(shí)體器官移植后的患者,可以通過下調(diào)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶來抑制T細(xì)胞活化,從而預(yù)防移植物抗宿主或急性排斥反應(yīng)。Martynova等[21]對(duì)21例AA患者應(yīng)用ATG聯(lián)合他克莫司治療發(fā)現(xiàn),在12個(gè)月時(shí)有14例(66.7%)患者獲得血液學(xué)反應(yīng)。雷帕霉素通過抑制mTOR信號(hào)通路抑制T細(xì)胞的增殖和線粒體代謝,阻滯細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期,并通過AA小鼠的動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證,為臨床治療提供了新思路[22]。二甲雙胍作為治療糖尿病的主要藥物,具有不良反應(yīng)少、價(jià)廉以及療效確切等優(yōu)點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍除降糖外,還發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞分化、抗腫瘤、抑制血管病變、抗衰老等作用,其機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)和C/EBPα家族的活性從而抑制骨髓內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,同時(shí)對(duì)異常的T細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié),刺激多能造血干細(xì)胞生長(zhǎng),從而間接發(fā)揮造血支持作用,這也驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性。同時(shí),本課題組通過臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),二甲雙胍聯(lián)合環(huán)孢素等藥物治療rAA具有一定的療效,40例患者在治療后1、3、6、12個(gè)月分別有70%、70%、80%、88%的患者獲得血液學(xué)反應(yīng),且中位血紅蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)相對(duì)于基線明顯增加,患者擺脫輸血依賴,與既往研究中CsA聯(lián)合ATG并添加第3種免疫抑制劑或生長(zhǎng)因子對(duì)rAA患者的療效相比,總緩解率有所增加。雖本研究在原有研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大了樣本量,但樣本量總數(shù)尚不足,鹽酸二甲雙胍對(duì)AA確切的遠(yuǎn)期療效尚需未來開展更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)加以進(jìn)一步證實(shí)。

miRNA作為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,其在AA的發(fā)病過程中起著重要作用,AA中miRNA與mRNA之間的調(diào)控關(guān)系并非是簡(jiǎn)單的線性調(diào)控,而是錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,仍需進(jìn)一步研究揭示表觀遺傳學(xué)在AA中的具體機(jī)制。本研究為miRNA在調(diào)控AA發(fā)病過程中的作用以及靶向治療提供了新思路并預(yù)測(cè)得到包括雷帕霉素、二甲雙胍等在內(nèi)的對(duì)AA可能具有治療效果的藥物。因AA的發(fā)病率低,現(xiàn)有的骨髓樣本較少,后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證骨髓T細(xì)胞中的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)及其生物學(xué)功能,為AA的治療提供理論依據(jù)。